四種淡水魚致敏蛋白免疫原性研究

劉楚怡，劉 蓉，薛文通，張 惠

(中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083)

四種淡水魚致敏蛋白免疫原性研究

劉楚怡，劉 蓉，薛文通*，張 惠

(中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083)

對常見的食物過敏原，草魚(Ctenopharyngodon idellus)、烏鱧(Ophicephalus argus)、鲇魚(Silurus asotus)、花鱸(Lateolabrax japonicus)四種淡水魚進行了特異性抗原的識別，通過coca’s緩沖液分別于四類魚肌肉組織中提取蛋白粗提液，經(jīng)SDS－PAGE分離出多種分子量不同的蛋白組分并對其進行分析，再通過Western－blotting識別四種淡水魚過敏原研究其免疫原性。由SDS－PAGE電泳分別得到四種淡水魚全蛋白電泳圖，通過免疫印跡等方法發(fā)現(xiàn)草魚與IgE結(jié)合的陽性帶主要有4條(107、62、50、27ku)，烏鱧與IgE結(jié)合的陽性帶主要有6條(62、50、34、32、28、17ku)，鲇魚與IgE結(jié)合的陽性帶主要有4條(62、50、39、37ku)，花鱸與IgE結(jié)合的陽性帶主要有6條(62、50、37、34、32、18ku)。

淡水魚，免疫印跡，食物過敏原

食品過敏反應發(fā)生率呈逐年上升趨勢，已成為當今世界普遍存在的問題，它嚴重影響到部分人群的生活質(zhì)量［1－2］。食品過敏是人體對食品中的抗原物質(zhì)產(chǎn)生的由免疫系統(tǒng)介導的不良反應，能夠引起這種不良反應的抗原物質(zhì)即為食品過敏原。據(jù)統(tǒng)計，90%以上的過敏反應是由8類，共170種富含蛋白質(zhì)的食物引起的。作為世界糧農(nóng)組織FAO(1995)報告的八類主要過敏食物中的一類，魚類已成為最常見的食品過敏原之一［3］。美國嬰幼兒魚類過敏的發(fā)生率為0.1%，成人為0.4%［4］。瑞典和冰島地區(qū)魚類過敏的發(fā)生率為0.2%［5］。在亞洲，由于飲食習慣的問題，魚類致敏的現(xiàn)象顯得更為突出。日本調(diào)查全國范圍內(nèi)2001～2002年速發(fā)型食物過敏性疾病，結(jié)果指出食物過敏病例中4.4%是由魚類引發(fā)的［6］。呂相征對中國醫(yī)科大學學生的調(diào)查表明，魚類過敏人數(shù)占總過敏人數(shù)的18.2%，對于過敏者為最多［7］。我國是世界淡水養(yǎng)殖大國，淡水產(chǎn)品產(chǎn)量世界第一。淡水魚占我國漁業(yè)總量的41.5%左右。在淡水養(yǎng)殖品種結(jié)構(gòu)中，由淡水魚引起的過敏癥在我國也最為常見，這極大地影響了我國魚類制品的安全性，降低了其市場普及和魚產(chǎn)品的利用價值。到目前為止，對食品過敏還沒有非常有效的治療方法，對于食品過敏的防治唯一有效的方法就是嚴格控制和避免特定食品的攝入。因此，對于淡水魚致敏蛋白的識別，以及對其致敏性的研究，在過敏原的防治以及開發(fā)低致敏食品方面都具有重要的理論指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

新鮮草魚、烏鱧、鲇魚、花鱸 購于中國農(nóng)業(yè)大學家屬區(qū)市場;0.02mol/L pH7.5的Tris－HCl緩沖液、pH8.3的coca’s提取液、pH8.3的25mmol/L Tris－192mmol/L甘氨酸緩沖液、4－氯－1－萘酚、電泳所需試劑、硝酸纖維素膜(Amersham RPN303C)、立春紅

sigma公司;魚類過敏患者血清 大慶市油田總醫(yī)院皮膚科;蛋白標準品 10～200ku;HRP標記的羊抗人IgE抗體;牛血清白蛋白標準品。

GL－20B高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠;AE－6450垂直電泳槽、AE－8450 1000V電源 日本ATTO公司;DYY－Ⅲ7B型轉(zhuǎn)移電泳儀、DYY－Ⅲ40B型轉(zhuǎn)移電泳槽 北京六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚肉蛋白的提取 從市場買回新鮮淡水魚，除去魚皮、魚骨以及內(nèi)臟，取魚肌肉，切成碎塊，放入絞肉機中絞碎，加入2倍體積的 coca’s提取液(pH8.3)提取，均質(zhì)機13000r/min均質(zhì)5min后，在4℃下以12000r/min轉(zhuǎn)速離心20min，取上清液。將上清液收集冷凍干燥后成粉狀保存待用。

1.2.2 SDS－PAGE 采用不連續(xù)體系SDS－PAGE垂直板凝膠電泳，濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為12.5%，恒流30mA，溴酚藍標記電泳完成后經(jīng)考馬斯亮藍R250染色20min，脫色。標準蛋白分子量范圍為10～200ku之間的14種多肽。

1.2.3 轉(zhuǎn)移電泳 按照進行SDS－PAGE電泳后的凝膠的大小剪取NC膜(0.45μm)。將膠和膜放入電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡20min，NC膜接正極，凝膠面接負極，在150V恒壓下，于4℃冰箱中電轉(zhuǎn)1.5h。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，凝膠用考馬斯亮藍R－250染色，NC膜用立春紅染色，觀察轉(zhuǎn)移效果，轉(zhuǎn)移完全的膜用于免疫印跡［8］。

1.2.4 血清池的建立 取3份陰性血清和12份魚過敏患者陽性血清分別等體積混合，制成陰性血清和陽性血清池，300μL/tube分裝于－20℃冰箱中保存。

1.2.5 免疫印跡(Western－blotting) 用2%BSA于4℃封閉過夜后，將NC膜放人10位對魚過敏患者的血清池(1∶10稀釋)中。在4℃冰箱中孵育5h，用TBST清洗3次。將NC膜轉(zhuǎn)入HRP標記羊抗人IgE抗體(1∶2000稀釋)中振搖0.5h，TBST清洗3次。將NC膜加入辣根過氧化物酶底物溶液顯色，待條帶清晰后即用雙蒸水沖洗，終止顯色反應。

2 結(jié)果與討論

2.1 四種淡水魚肌肉全蛋白電泳圖

四種淡水魚的總蛋白的SDS－PAGE電泳結(jié)果顯示，其蛋白含量豐富，不同的魚的總蛋白條帶存在不同，分子量廣泛分布于10～150ku之間。其中草魚共有28條蛋白帶，豐度較高的蛋白條帶分子量分別為107、50、39、37、34、12ku，共6條;烏鱧共有24條蛋白帶，其中豐度較高的7條蛋白條帶分子量為107、62、50、39、37、34、11ku;鲇魚共有29條蛋白帶，主帶為8條，分別在分子量為107、50、39、37、32、14、13、12ku處可見豐度較高的蛋白條帶;而花鱸共有25條蛋白帶，主帶為8條，分別在107、50、39、37、35、18、14、10ku處。結(jié)果見圖1。

2.2 四種淡水魚致敏蛋白的識別

SDS－PAGE電泳后用由22位經(jīng)檢測對魚過敏患者的陽性血清組成的血清池為一抗，HRP標記羊抗人IgE作為二抗，對四種魚的總蛋白進行免疫印跡分析，結(jié)果見圖2。草魚與IgE結(jié)合的陽性帶主要有4條(107、62、50、27ku);烏鱧與IgE結(jié)合的陽性帶主要有6條(62、50、34、32、28、17ku)，鲇魚與IgE結(jié)合的陽性帶主要有4條(62、50、39、37ku)，花鱸與IgE結(jié)合的陽性帶主要有6條(62、50、37、34、32、18ku)。

圖1 四種淡水魚蛋白SDS－PAGE電泳圖

圖2 魚過敏陽性血清對四種淡水魚蛋白Western Blotting圖

3 結(jié)論

本文對常見的四種淡水魚草魚、烏鱧、鲇魚、花鱸的肌肉蛋白進行了特異性抗原的識別，結(jié)果表明，草魚存在4條致敏條帶、烏鱧有6條主要致敏帶、鲇魚致敏條帶為4條、花鱸存在6條蛋白帶與陽性血清反應。

本研究與文獻報道中鱈魚等海水魚的主要致敏蛋白為12ku的小清蛋白［9－10］的結(jié)論不同，在對這四種淡水魚的免疫印記中并未發(fā)現(xiàn)小清蛋白引起過敏反應。四種魚中62ku和50ku的蛋白都明顯致敏，但不同種魚引起過敏的主要蛋白仍然存在差異。分析認為其致敏蛋白存在差異與魚類種屬不同有關(guān)。雖然四種魚都屬于輻鰭魚亞綱但分屬不同目。草魚為鯉形目草食魚，與另外三種比較其致敏性較低，存在27ku的致敏蛋白。烏鱧和花鱸屬于鱸形目，兩者在34、32、17～18ku處的蛋白都引起過敏。鲇魚是鯰形目，致敏性較鱸形目的烏鱧和花鱸低，但高于鯉形目草魚。

淡水魚引起的過敏癥極大地影響了我國魚類制品的安全性，降低了其市場普及和魚產(chǎn)品的利用價值。因此，對于淡水魚致敏蛋白的識別，以及對消除致敏蛋白致敏性的研究，在治療超敏反應疾病和研究開發(fā)低致敏食品方面都具有重要的理論指導意義。

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Identification of major allergens from four kinds of freshwater fishes

LIU Chu－yi，LIU Rong，XUE Wen－tong*，ZHANG Hui
(College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China)

Aiming to investigate the major allergens of the following four kinds of freshwater fishes，Grass carp (Ctenopharyngodon idellus)，Snakehead(Ophicephalus argus)，Catfish(Silurus asotus)and Japanese sea perch (Lateolabrax japonicus)were studied.Fish muscle was extracted in the same volume of coca’s buffer(pH 8.3).The relative contents of major allergens were quantified by SDS－PAGE densitometry.Immunoblot on the four kinds of freshwater fish protein extracts were performed with sera from 12 eczema patients with serum specific immunoglobulin E of fish proteins.In result，the major allergen of Grass carp was 107，62，50，27ku protein.There were 6 major allergic protein of Snakehead which were 62，50，34，32，28，17ku.The positive protein which were connected with the specific immunoglobulin E of Catfish were 62，50，39，37ku protein.Japanese sea perch major allergen were 62，50，37，34，32，18ku protein.

freshwater fish;western－blotting;food allergen

TS254.1

A

1002－0306(2011)11－0164－03

2010－10－13 *通訊聯(lián)系人

劉楚怡(1986－)，女，博士研究生，研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。