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    眼皮膚白化病研究的新途徑及TYR基因2種新突變的分析*

    2011-10-24 02:01:11廖沛熙蔣瑋瑩李洪義
    中國(guó)病理生理雜志 2011年3期
    關(guān)鍵詞:白化病毛球證者

    廖沛熙, 李 卓, 逄 婷, 蔣瑋瑩△, 李洪義△

    (1中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510080;2香港科技大學(xué)理學(xué)院生命科學(xué)部,中國(guó)香港 九龍;3中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室,廣東 廣州 510080)

    眼皮膚白化病研究的新途徑及TYR基因2種新突變的分析*

    廖沛熙1, 李 卓2, 逄 婷3, 蔣瑋瑩3△, 李洪義3△

    (1中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510080;2香港科技大學(xué)理學(xué)院生命科學(xué)部,中國(guó)香港 九龍;3中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室,廣東 廣州 510080)

    目的探討自眼皮膚白化病(OCA)患者毛發(fā)提取DNA對(duì)OCA分型研究的可行性及TYR基因2種新突變的致病性。方法應(yīng)用毛發(fā)壓片鏡檢,PCR擴(kuò)增毛發(fā)DNA中OCA相關(guān)基因各外顯子、外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)及啟動(dòng)子區(qū),直接以序列測(cè)定技術(shù)分析患者基因突變,明確患者的基因型。對(duì)于發(fā)現(xiàn)的新突變,采用突變等位基因頻率等方法對(duì)其進(jìn)行深入研究。結(jié)果3個(gè)家系的先證者均為1型OCA。家系1的先證者為c.715C>T (p.R239W)和c.929insC (p.P310PfsX7)突變的復(fù)合雜合子;家系2的先證者為c.896G>A (p.R299H)的純合子;家系3的先證者為c.1362+3A>T和c.650G>C (p.R217P)突變的復(fù)合雜合子。其中,c.1362+3A>T和c.650G>C (p.R217P)突變?yōu)橹两裆形磮?bào)道的新突變,通過(guò)對(duì)新突變進(jìn)行分析,推測(cè)其極可能為病理性新突變。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功證實(shí)從毛發(fā)中提取DNA的方法對(duì)OCA分型研究的可行性,同時(shí)確定了2種致病性新突變,為今后OCA研究開(kāi)拓了新的思路和途徑。

    眼皮膚白化??; 毛發(fā); 基因突變

    眼皮膚白化病(oculocutaneous albinism, OCA)是一組以皮膚、毛發(fā)、眼黑色素生物合成障礙以及眼和皮膚功能異常為主要臨床表現(xiàn)的疾病[1]。依據(jù)致病基因的不同,目前將OCA分為4型[2-5],分別是酪氨酸酶基因(tyrosinase,TYR)突變導(dǎo)致的OCA1、P蛋白基因(P)突變導(dǎo)致的OCA2、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1基因(tyrosinase-related protein 1,TYRP1)突變引起的OCA3和溶質(zhì)載體家族45成員2基因(solute carrier family 45, member 2,SLC45A2)突變所致的OCA4。各型OCA均呈常染色體隱性遺傳,具有明顯的危害。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外針對(duì)OCA的診斷方法主要是從患者外周血液標(biāo)本中獲取DNA進(jìn)行分析[6-8],然而此方法存在創(chuàng)傷性、不安全性以及運(yùn)輸儲(chǔ)藏不方便等不足之處。本課題組擬通過(guò)從毛球中提取DNA的方法,將毛發(fā)應(yīng)用于眼皮膚白化病的遺傳異質(zhì)性研究中,對(duì)于眼皮膚白化病的臨床和基因診斷都具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

    材 料 和 方 法

    1材料

    3個(gè)OCA家系。家系1,先證者,男,8歲,頭發(fā)白,皮膚白,虹膜淡灰色,瞳孔反光紅色,水平中速眼球震顫,無(wú)斜視,視力低下。家系2,先證者,女,12歲,頭發(fā)白,皮膚白,虹膜灰白色,瞳孔反光紅色,水平中速眼球震顫,輕度斜視,視力低下。家系3,先證者,女,30歲,頭發(fā)白,皮膚白,虹膜灰白色,瞳孔反光暗紅色,輕度斜視,水平低速眼球震顫,視力低下。3例先證者臨床診斷均為OCA1,其父母表型均正常且非近親婚配,見(jiàn)表1。收集3個(gè)OCA家系及50名正常人頭發(fā)各若干根。無(wú)水乙醇清洗、蒸餾水漂洗后,自然風(fēng)干待用。

    2方法

    2.1研究策略 光學(xué)顯微鏡下分別壓片觀察正常人黑色毛發(fā)、正常人白色毛發(fā)及白化病患者毛發(fā)的毛球結(jié)構(gòu),拍攝典型形態(tài),以便指導(dǎo)臨床診斷。根據(jù)臨床診斷分析患者毛發(fā)DNA的OCA相關(guān)基因是否存在突變,隨后檢測(cè)患者父母相應(yīng)基因的特定位點(diǎn),明確突變的親代來(lái)源,從而確定患者的OCA基因型。對(duì)于新發(fā)現(xiàn)的突變,采用突變等位基因頻率等方法對(duì)其進(jìn)行深入研究。

    2.2毛發(fā)基因組DNA提取 取3個(gè)OCA家系先證者及其父母毛發(fā)各5根,存放20-30 d后,每根毛發(fā)靠近毛根約0.5 cm將毛球部剪下,采用?;锟萍加邢薰咎峁┑拿l(fā)微量基因組DNA提取試劑盒(HaiGene,Cat.No:B0503),按說(shuō)明書(shū)操作提取毛發(fā)基因組DNA。

    2.3PCR引物設(shè)計(jì)與合成 從UCSC Genome Bioinformatics數(shù)據(jù)庫(kù)(http://genome.ucsc.edu/)中提取TYR基因(NM_000372)、P基因(NM_000275)、TYRP1基因(NM_000550)和SLC45A2基因(NM_016180)相關(guān)序列作為標(biāo)準(zhǔn)序列,根據(jù)此序列自行設(shè)計(jì)特異性引物,擴(kuò)增范圍包括基因全部外顯子、外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)以及啟動(dòng)子區(qū)。全部引物由上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成。本文涉及的引物序列、相應(yīng)的擴(kuò)展產(chǎn)物長(zhǎng)度以及退火溫度均已列出,見(jiàn)表2。

    2.4PCR反應(yīng) 反應(yīng)總體系為30 μL,內(nèi)含Mg2+2.5 mmol/L,dNTP 2.5 mmol/L,Tag酶1.5 U,上、下游引物各0.17 μmol/L,10×硫酸銨緩沖液3 μL,DNA模板50 ng,超純水16.5 μL。 擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃ 30 s,按照各自復(fù)性溫度(50-64 ℃)退火40 s,72 ℃ 50 s,32個(gè)循環(huán)后,72 ℃ 8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,紫外光下觀察和記錄擴(kuò)增結(jié)果。

    2.5DNA序列測(cè)定 OCA相關(guān)基因各擴(kuò)增片段直接測(cè)序;對(duì)檢出的DNA序列變異經(jīng)雙向測(cè)序核實(shí)后,進(jìn)一步對(duì)其父母相應(yīng)片段進(jìn)行序列測(cè)定,確定患者及其父母的基因型。純化和測(cè)序工作由上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司完成。

    2.6突變等位基因頻率法 對(duì)于研究中發(fā)現(xiàn)的新突變,通過(guò)對(duì)50名(100個(gè)等位基因)無(wú)白化病表型且無(wú)親緣關(guān)系的正常人進(jìn)行新突變等位基因篩查,探討突變致病的可能性。

    結(jié) 果

    1毛發(fā)組織形態(tài)學(xué)觀察

    光學(xué)顯微鏡下可觀察到正常人黑色毛發(fā)、白色毛發(fā)、白化病患者(家系1先證者)的毛球及毛干結(jié)構(gòu),且分別對(duì)上述三者5倍、10倍、20倍的成像圖進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,正常人黑色毛發(fā)可見(jiàn)明顯的毛球及毛干結(jié)構(gòu),如髓質(zhì)、皮質(zhì)、毛小皮等結(jié)構(gòu);正常人白色毛發(fā)可見(jiàn)毛球結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的退化,髓質(zhì)、皮質(zhì)結(jié)構(gòu)不清;白化病患者毛發(fā)可見(jiàn)毛球及毛干結(jié)構(gòu)存在,可見(jiàn)髓質(zhì)、皮質(zhì)結(jié)構(gòu),但未見(jiàn)明顯黑色髓質(zhì)及黑色素細(xì)胞,見(jiàn)圖1。

    2家系1OCA1突變分析

    家系1先證者毛發(fā)DNA的TYR基因第1和第2外顯子檢測(cè)到2種國(guó)際白化病數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)報(bào)道的致病性突變,即c.715C>T (p.R239W)和c.929insC (p.P310PfsX7),其它擴(kuò)增片段未見(jiàn)異常。對(duì)其父母相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行序列分析,發(fā)現(xiàn)父母分別為c.715C>T (p.R239W)和c.929insC (p.P310PfsX7)突變的雜合子,故可以肯定先證者為此兩種突變的復(fù)合雜合子,見(jiàn)圖2。

    Figure 1. Morphological features of hair bulb tissues (a,×5; b,×10; c,×20). 1: black hair control group; 2: white hair control group; 3: OCA-patient hair group.

    圖1各組毛發(fā)組織形態(tài)學(xué)改變

    Figure 2. Hair DNA sequencing in family 1.

    圖2家系1的毛發(fā)DNA測(cè)序結(jié)果

    3家系2OCA1突變分析

    家系2先證者毛發(fā)DNA的TYR基因第2外顯子檢測(cè)到1種國(guó)際白化病數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)報(bào)道的純合性突變c.896G>A (p.R299H),其它擴(kuò)增片段未見(jiàn)異常,對(duì)其父母相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行序列分析,發(fā)現(xiàn)父母分別為c.896G>A (p.R299H)突變的雜合子。故可以肯定先證者為此突變的純合子,見(jiàn)圖3。

    Figure 3. Hair DNA sequencing in family 2.

    圖3家系2成員及正常對(duì)照的毛發(fā)DNA測(cè)序結(jié)果

    4家系3OCA1突變分析

    家系3先證者毛發(fā)DNA的TYR基因第1和第4外顯子檢測(cè)到2種國(guó)際白化病數(shù)據(jù)庫(kù)未見(jiàn)報(bào)道的突變,即c.1362+3A>T和c.650G>C(p.R217P),其它擴(kuò)增片段未見(jiàn)異常,對(duì)其父母相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行序列分析,發(fā)現(xiàn)父母分別為c.1362+3A>T和c.650G>C(p.R217P)突變的雜合子,對(duì)上述突變進(jìn)行生物信息學(xué)等相關(guān)分析,其為致病性突變的可能性很大。對(duì)其弟弟進(jìn)行上述突變位點(diǎn)的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其弟弟的基因型與患者相同,均為c.1362+3A>T/c.650G>C(p.R217P),見(jiàn)圖4。

    Figure 4. Hair DNA sequencing in family 3.

    圖4家系3的毛發(fā)DNA測(cè)序結(jié)果

    5新突變c.1362+3A>T和c.650G>C(p.R217P)的分析

    上述兩種新突變?cè)?0名(100個(gè)等位基因)無(wú)白化病表型且無(wú)親緣關(guān)系的正常人中進(jìn)行篩查時(shí),均未見(jiàn)上述突變。家系3先證者的同胞弟弟也是OCA患者(Ⅱ:2)具有與先證者相同的TYR基因型。c.1362+3位的堿基由A變?yōu)門后,破壞了5’端剪接體的結(jié)構(gòu),可能通過(guò)影響mRNA前體剪接的正常進(jìn)行,改變了翻譯后酶蛋白長(zhǎng)度,從而影響了酶的催化活性。R217P突變是由堿性親水性氨基酸(精氨酸)變?yōu)橹行允杷园被?脯氨酸),有研究表明R217位點(diǎn)的突變可引起OCA1A表型,亦可引起OCA1B表型[15]。

    表1 本研究3個(gè)OCA家系先證者臨床表現(xiàn)及基因診斷

    *Novel mutations.M:male;F:female.

    表2 TYR基因PCR擴(kuò)增引物

    討 論

    眼皮膚白化病具有較高的遺傳異質(zhì)性和等位基因異質(zhì)性,盡管各種分型OCA患者的皮膚、毛發(fā)和眼均具有低色素表型及相應(yīng)的危害,但不同分型之間以及同型不同個(gè)體之間臨床表現(xiàn)依然交錯(cuò)重疊、輕重不一,致使臨床上僅從癥狀和體征上難以確診患者的OCA分型,因而提取患者DNA、分析其基因異質(zhì)性在優(yōu)生遺傳咨詢和產(chǎn)前基因診斷上具有不可替代的作用。

    毛發(fā)作為人體的皮膚附屬器之一,具有分布廣泛、易于獲取等特點(diǎn)。毛發(fā)可分為毛干、毛根和毛球3部分,其中毛球是由毛根和毛囊上皮鞘融合而成。毛球中的毛母質(zhì)細(xì)胞是一種增殖活躍的干細(xì)胞,形成毛根和上皮鞘的細(xì)胞,故其中含有豐富的染色體等遺傳物質(zhì)[9,10]。此外,毛發(fā)的黑素細(xì)胞主要存在于毛球的基底部,其合成分泌黑色素顆粒障礙正是引起毛發(fā)低色素表現(xiàn)的主要原因。通過(guò)光鏡觀察對(duì)比正常人黑色毛發(fā)、白色毛發(fā)及白化病患者毛發(fā),我們發(fā)現(xiàn)白化病患者的毛發(fā)基本結(jié)構(gòu)清晰存在,沒(méi)有發(fā)生明顯的退化表現(xiàn),但在毛球部分不能看到明顯的黑色素細(xì)胞且毛發(fā)的髓質(zhì)顏色較淺,這與白化病患者的臨床表現(xiàn)和發(fā)病機(jī)制相吻合。因此從毛球中提取分析DNA具有組織學(xué)上的基礎(chǔ)和可行性。

    以往對(duì)OCA的研究材料多是抽取患者的外周血,但此方法存在不足之處:給患者身體帶來(lái)一些創(chuàng)傷,血液不便于遠(yuǎn)途運(yùn)輸;樣品獲取及提取DNA的過(guò)程中會(huì)發(fā)生一些實(shí)驗(yàn)室安全事件等。自Bradifield等[11]首次從頭發(fā)中提取核酸以來(lái),毛發(fā)已成為應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)的常用檢測(cè)材料之一[12]。但是,毛發(fā)應(yīng)用于眼皮膚白化病的研究至今少有報(bào)道[13],其取樣方便、快捷,病人痛苦少,近乎無(wú)創(chuàng),存放時(shí)間長(zhǎng)。這也符合現(xiàn)今醫(yī)療微創(chuàng)、便捷和準(zhǔn)確的趨勢(shì),對(duì)將來(lái)OCA診斷和研究方法的改進(jìn)提供了新思路。

    本研究對(duì)所發(fā)現(xiàn)的兩種OCA新突變c.1362+3A>T和c.650G>C(p.R217P)進(jìn)行了突變分析,突變IVS4+3A>T通過(guò)影響mRNA的正常剪接,導(dǎo)致翻譯后酪蛋白長(zhǎng)度改變,從而影響酪氨酸酶的催化活性。此外,有文獻(xiàn)報(bào)道[14,15]c.1362+4A>G和c.1362+5A>G為致病性突變,它們緊鄰c.1362+3位點(diǎn)并位于其后。對(duì)于c.650G>C(p.R217P)突變,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,p.R217位點(diǎn)存在p.R217W、p.R217Q和p.R217S 3種突變[16],都是堿性氨基酸變?yōu)橹行园被?,但在各物種之間蛋白質(zhì)比對(duì)中發(fā)現(xiàn)p.R217位點(diǎn)并不保守,說(shuō)明該位點(diǎn)在酪氨酸酶結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮的作用并非特別重要,它們既可引起OCA1A表型,也可引起OCA1B表型,提示本文發(fā)現(xiàn)的c.650G>C(p.R217P)突變同樣具有上述特點(diǎn)。家系3先證者及同胞弟弟均有這兩種新突變,且他們都是OCA1A的患者,因而進(jìn)一步支持兩種突變具有致病性。另外,對(duì)于上述新突變,本研究還在50名(100個(gè)等位基因)無(wú)白化病表型且無(wú)親緣關(guān)系的正常人中進(jìn)行了篩查,結(jié)果均未見(jiàn)上述2種突變,因而我們認(rèn)為c.1362+3A>T和c.650G>C(p.R217P)突變?yōu)橹虏⌒孕峦蛔儭?/p>

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明從毛發(fā)提取DNA進(jìn)行OCA分型診斷與研究的可行性,為今后推廣使用奠定了基礎(chǔ);同時(shí)確定了2種致病性新突變,為我國(guó)OCA分型診斷、產(chǎn)前基因診斷以及分子發(fā)病機(jī)制研究積累了重要資料。

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    AnewmethodforoculocutaneousalbinismtypingandanalysisoftwonovelmutationsinTYRgene

    LIAO Pei-xi1, LI Zhuo2, PANG Ting3, JIANG Wei-ying3, LI Hong-yi3

    (1GuanghuaSchoolofStomatology,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;2DivisionofLifeScience,SchoolofScience,HongKongUniversityofScienceandTechnology,Kowloon,HongKong,China;3DepartmentofMedicalGenetics,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:jweiying@mail.sysu.edu.cn;lihongyi@mail.sysu.edu.cn)

    AIM: To establish a new approach to oculocutaneous albinism(OCA) classification using the DNA extracted from hair bulb and identify two novel pathogenic mutations inTYRgene.METHODSThe morphological changes of hair bulb tissues were observed under optical microscope. The target DNA fragments of axons, promoter and exon-intron adjacent were amplified by PCR, followed by direct DNA sequencing. The novel mutations were further analyzed using mutant allele frequency method.RESULTSThe 3 probands were all tyrosinase-related OCA(OCA1). The proband in family 1 showed as a compound heterozygote with mutants of c.715C>T (p.R239W) and c.929insC (p.P310PfsX7). The proband in family 2 showed as a homozygote with c.896G>A (p.R299H). The proband in family 3 was a compound heterozygote with mutants of c.1362+3A>T and c.650G>C (p.R217P). The mutations of c.1362+3A>T and c.650G>C (p.R217P) were novel. The result of mutant allele frequency indicated that the novel mutations were most likely pathological mutations.CONCLUSIONWe successfully establish a feasible approach to OCA classification using the DNA extracted from hair bulb,and identify two novel mutations.

    Oculocutaneous albinism; Hair; Gene mutation

    R394.3

    A

    1000-4718(2011)03-0571-06

    2010-11-16

    2011-01-17

    國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30672003);廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(No.A2009351);中山大學(xué)醫(yī)科學(xué)生科研項(xiàng)目(No.2009-11)

    △通訊作者 Tel: 020-87330828;E-mail: jweiying@mail.sysu.edu.cn;lihongyi@mail.sysu.edu.cn

    10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.029

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