微生物能力驗證樣品制備工藝及水產品企業(yè)水平測試結果評價

周向陽，王淑娜，鄢建輝，沈 飚，胡興娟，朱炳林

（1.舟山出入境檢驗檢疫局，浙江舟山 316000；2.杭州市原種場，浙江杭州 311115；3.浙江大學動物預防醫(yī)學研究所，浙江杭州 310029）

能力驗證是實驗室外部質量控制的有效措施之一，也是計量認證和實驗室認可的必備要求。水產品企業(yè)實驗室的微生物檢驗能力不僅關系著出口企業(yè)的經(jīng)濟效益，也將影響到水產品的衛(wèi)生與安全。為了進一步提高舟山市水產品企業(yè)微生物檢驗的工作質量，舟山出入境檢驗檢疫局科技認證處與舟山檢科分院合作，根據(jù)該巿檢驗檢疫工作的特點和水產品待檢項目的要求，選取了3個常規(guī)的檢測項目，即菌落總數(shù)、副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌檢測，于2009年對該巿88家水產品企業(yè)開展實驗室檢測能力驗證。

目前，微生物學檢驗領域尚無高可信度、高通量的微能力驗證制備技術，且在菌落總數(shù)的檢測項目上無標準菌株，這些微生物檢驗中的不確定性因素，使得實驗室間能力驗證的可信度打折[1]。同時，部分商品化的微生物能力驗證樣品價格比較昂貴，也不能完全符合某地區(qū)某類型水平測試的特點。有研究認為，冷凍干燥技術保存微生物可以維持細菌生物學特性，且樣品也易于保存和運輸，其在微生物能力驗證樣品的制備方面有良好應用前景[2]。因此，筆者探索并采用冷凍干燥技術制備了一批副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌檢測以及菌落計數(shù)的微生物能力驗證樣品，在對水產品企業(yè)實驗室進行檢驗水平測試的同時，也給這些企業(yè)實驗室檢測水平的進一步提高提供了建議。

1 材料與方法

1.1 微生物菌株

副溶血弧菌（VP）、擬態(tài)弧菌（VM）由浙江大學動物預防醫(yī)學研究所提供；金黃色葡萄球菌（SA）、表皮葡萄球菌（SE）由舟山出入境檢驗檢疫局水產品實驗室保存。

1.2 試劑與儀器

所用試劑有脫脂奶粉、甘油、NaCl、BHI培養(yǎng)基、TCBS瓊脂、Baird-Park瓊脂、冷凍保存液A（含8%奶粉、4%甘油、0.3%NaCl）、冷凍保存液B（含8%奶粉、4%甘油）等；主要儀器有生化培養(yǎng)箱、超凈工作臺、普通冷凍離心機、酶標儀、冷凍干燥機、低溫冰箱、超低溫冰箱等。

1.3 能力驗證樣品的制備方法

1.3.1 細菌的培養(yǎng)

副溶血弧菌、擬態(tài)弧菌在含3%NaCl的BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 h左右，2 000 r/min離心10 min，沉淀用冷凍保存液A混懸均勻，并調整OD600至0.3，兩菌等量混合后進行10倍梯度稀釋。金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌在BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心后用冷凍保存液B混懸，調整OD600為0.4，等量混合并進行梯度稀釋。另外，取部分金黃色葡萄球菌混懸液，稀釋至合適濃度進行菌落總數(shù)的測定。

1.3.2 制備工藝

將調整好濃度的細菌混合/懸液分裝至安瓶，每瓶1mL；安瓶放于-20℃低溫預先凍結1 h，立即轉至-80℃超低溫冰箱冷凍12 h左右；提前2 h打開冷凍干燥機使冷凝器降至-40℃以下的工作溫度，抽真空并使真空度達100 μ Hg以上，然后將安瓶均勻置于冷凍室內擱板上，升華干燥50 h左右；待安瓶里內容物具有一定的物理形態(tài)，呈現(xiàn)乳白色疏松海綿狀，則改變儀器狀態(tài)進行解析干燥2 h，除去內容物里的結合水成分；進行封口、壓蓋、貼簽，并于4℃冰箱貯存。

1.3.3 能力驗證樣品的質量檢查

分別取制備好的微生物凍干樣品各10瓶，用營養(yǎng)肉湯復水后按照標準方法進行測定；4℃保存1個月后，同法測定，通過測定結果比較進行樣品均勻性與穩(wěn)定性的驗證。

1.4 考核項目與要求

1.4.1 菌落總數(shù)

無菌開啟凍干樣品瓶蓋，用5 mL稀釋液溶解其中的凍干粉末，進行細菌總數(shù)的測定，也可參照SN/T 0168-1992《出口食品平板菌落計數(shù)》進行計數(shù)。

1.4.2 能力驗證樣品中致病菌的檢測

無菌開啟凍干樣品瓶蓋，用5 mL待檢菌生長適宜的營養(yǎng)肉湯溶解其中的凍干粉末，并置于36±1℃恒溫箱中培養(yǎng)8 h。為更好地分離到目標菌，建議在選擇性平板上進行劃線分離。其它步驟也可以參考現(xiàn)行國家或行業(yè)標準進行操作。

1.4.3 報告要求

所有參加考核的實驗室需在領取樣品一周后報告試驗結果，同時要提交詳細的檢驗原始記錄，并加蓋企業(yè)公章。若實驗室采用非標準方法，需對檢驗方法進行描述。

1.5 考核結果評價方法

參考GB/T 15483.1-1999標準，用國際上通用的穩(wěn)健統(tǒng)計技術，即Z比分數(shù)進行評價和分析菌落總數(shù)[3-4]。當穩(wěn)健Z比分數(shù)≤2為滿意值；2＜Z值＜3為尚可接受，為復查值；Z值≥3者為不滿意結果，為離群值。副溶血弧菌與擬態(tài)弧菌混合樣、金黃色葡萄球菌與表皮葡萄球菌混合樣、部分干擾盲樣（不含待檢目標菌）為隨機發(fā)放，檢測過程中要結合細菌菌落形態(tài)、生化反應進行判斷，報告為檢出或未檢出。

2 結果

2.1 能力驗證樣品的制備結果

按照上述冷凍干燥工藝制備微生物能力驗證樣品后，每批取10個樣品依行業(yè)標準方法進行質量檢查。菌落計數(shù)結果經(jīng)單因素方差分析[1]，方差比（F）值分別為1.82和1.67，小于F0.05的臨界值5.19，表明菌落計數(shù)樣品間金黃色葡萄球菌含量無顯著差異，其均勻性完全滿足水平測試的要求。能力驗證樣品中副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌的檢測結果均符合預期，生化試驗與真空冷凍干燥前期一致，且擬態(tài)弧菌和表皮葡萄球菌的含量也符合預設要求。另外，樣品于4℃條件下貯存1個月后重復檢測以上項目，菌落計數(shù)和致病菌檢測結果比對發(fā)現(xiàn)，細菌總數(shù)無明顯變化，細菌生化特性亦未改變，表明冷凍干燥樣品在4℃貯存時其穩(wěn)定性符合要求。

2.2 菌落總數(shù)計數(shù)的考核結果

對舟山市88家水產品企業(yè)的兩批菌落總數(shù)計數(shù)結果進行統(tǒng)計學處理，分別計算出其中位數(shù)和穩(wěn)健Z比分數(shù)，其中穩(wěn)健Z比分數(shù)≤2的水產品企業(yè)72家，總體滿意率為81.8%；結果尚可接受數(shù)為6，占總企業(yè)數(shù)的6.8%；結果不滿意者為9家，占10.1%。水產品企業(yè)實驗室菌落總數(shù)考核結果統(tǒng)計分析見表1。

表1 舟山巿水產品企業(yè)菌落總數(shù)能力驗證結果分析Tab.1 The results of colony counting proficiency testing of aquatic enterprises in Zhoushan

2.3 病原菌檢測的考核結果

根據(jù)不同水產品出口地的菌種限量要求，參加金黃色葡萄球菌檢測項目的水產品企業(yè)（主要出口歐盟、美國、加拿大等）56個，參加副溶血弧菌檢測項目的水產品企業(yè)（主要出口日本、韓國等）32個。在干擾樣品和混合樣品中，副溶血弧菌檢測的正確率較為理想，高達93.8%；而金黃色葡萄球菌檢測的滿意率較低，僅為82.1%，主要是由于表皮葡萄球菌與金黃色葡萄球菌兩種細菌在Baird-Park瓊脂上的菌落形態(tài)相似，或者檢驗人員對金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶試驗結果判斷失誤。

表2 舟山巿水產品企業(yè)病原菌檢測能力驗證結果分析Tab.2 The results of pathogenic bacterial proficiency testing of aquatic enterprises in Zhoushan

2.4 水平測試結果的綜合評價

在參加能力驗證的88家水產品企業(yè)中，菌落總數(shù)與致病菌檢測的結果均不合格的企業(yè)3家。菌落總數(shù)計數(shù)是水產品中微生物檢驗的必檢項目，但仍有9家企業(yè)計數(shù)結果存在較大偏差。通過檢測報告分析，其原因有：樣品梯度稀釋不均勻；數(shù)據(jù)單位換算錯誤：實驗前未對所用容器、試劑進行無菌核查而引入了外源性微生物。致病菌檢測共有11家未達到檢測要求，其原因有：干擾菌的設置提高了檢測的難度；檢測人員對同屬細菌的鑒別經(jīng)驗不足；對副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌的某些生化現(xiàn)象判斷不準等。另外，試驗過程中未進行空白對照實驗，未采用標準菌株進行確證試驗的不規(guī)范操作也很常見。

3 討論與分析

在冷凍干燥技術保存微生物研究的基礎上，我們探索并建立了冷凍干燥技術制備的微生物能力驗證樣品的工藝。針對副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌的最佳生長條件優(yōu)化了不同濃度與共溶點的冷凍保存液A和冷凍保存液B，并篩選適合能力驗證樣品的合適的細菌濃度，研究了樣品在真空條件下升華干燥的時間，即50 h左右即可減少內容物里90%以上的水分，而時間過短或過長都會改變或影響內容物的物理狀態(tài)。結果顯示，本研究以金黃色葡萄球菌為目標菌所制備的菌落計數(shù)樣品均勻性和穩(wěn)定性良好，用于致病菌檢測的樣品也符合質控盲樣的要求。另外，本研究對于冷凍干燥技術的探索，對于其它種類微生物能力驗證樣品的制備也提供了一定的技術參考。

能力驗證考核的是實驗室硬件與軟件的綜合實力。在硬件條件達標的情況下，只有不斷提高檢驗人員的檢測技術水平，才能實現(xiàn)對水產品原料或樣品中微生物的早發(fā)現(xiàn)早處理，并防止有安全隱患的水產品流入正常銷售渠道。綜合以上因素，舟山市水產品企業(yè)實驗室微生物的檢測能力正在不斷提高，但仍需從以下幾方面繼續(xù)加強實驗室檢驗質量控制工作：需要建立健全實驗室內部質量管理體系，制訂合理全面的檢驗規(guī)章制度；實驗室檢驗人員要加強業(yè)務素質培訓，定期參加實驗室檢測能力驗證；儀器設備、試劑使用前必須經(jīng)過儀器狀態(tài)和試劑質量核查；試驗室與無菌操作環(huán)境也要定期監(jiān)控與記錄[5]。

[1]盧行安,鄭 江,曹志軍,等.微生物能力驗證樣品均勻性試驗的研究[J].中國微生態(tài)學雜志,2003,15(1):33-34.

[2]董充慧,蘇 杭,張?zhí)亓?等.真空冷凍干燥技術在生物制藥方面的應用[J].沈陽藥科大學學報,2009,26(7):76-78.

[3]GB/T 15483.1利用實驗室間比對的能力驗證：能力驗證計劃的建立和運作[M].北京：中國標準出版社,2004.

[4]HORWITZ W,BRITTON P,CHIRTEL S J.A simple method for evaluating data from an inter laboratory study[J].J AOAC Int,1998,81(6):1 257-1 265.

[5]張秀麗,廖興廣,張 蒙,等.2003年河南省食品衛(wèi)生微生物檢驗質量控制考核結果的評價與分析[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2005,15(7):856-857.