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    大孔樹脂吸附純化青錢柳葉三萜化合物

    2011-10-13 08:07:12尹忠平上官新晨張月紅黎冬明吳少福陳繼光
    食品科學(xué) 2011年6期
    關(guān)鍵詞:青錢柳三萜類粗提物

    尹忠平,上官新晨,*,張月紅,黎冬明,吳少福,陳繼光

    (1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室,江西 南昌 330047;2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物資源開發(fā)與利用研究室,江西 南昌 330045)

    大孔樹脂吸附純化青錢柳葉三萜化合物

    尹忠平1,2,上官新晨1,2,*,張月紅2,黎冬明2,吳少福2,陳繼光2

    (1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室,江西 南昌 330047;2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物資源開發(fā)與利用研究室,江西 南昌 330045)

    為得到純度較高的青錢柳葉三萜化合物,采用大孔樹脂吸附法對青錢柳葉三萜粗提物進(jìn)行純化研究。靜態(tài)吸附實驗結(jié)果表明,AB-8樹脂對青錢柳葉三萜化合物吸附、解吸性能較好,比飽和吸附量為77.49mg/g,解吸率為85.44%,總回收率可達(dá)72.01%。AB-8樹脂動態(tài)吸附-解吸實驗表明:上柱流速增大,吸附率呈降低趨勢;隨著上柱液質(zhì)量濃度增大,吸附率先升后降;95%乙醇洗脫效果較好,10BV為合理用量;隨著洗脫流速增大,洗脫液峰濃度降低,洗脫率減小,綜合考慮以1.5mL/min較為適宜。經(jīng)AB-8樹脂純化后,三萜類物質(zhì)純度可達(dá)44.30%。

    青錢柳;三萜化合物;大孔樹脂;純化

    青錢柳(Cyclocarya paliurus(Batal.) Iljinsk)為我國特有的胡桃科青錢柳屬單種屬珍稀植物,主要分布于我國長江中下游地區(qū),當(dāng)?shù)厝藢⑵淙~制成降糖降脂保健茶飲用已有200多年歷史,江西修水青錢柳降糖神茶系列產(chǎn)品還取得了中國原產(chǎn)地標(biāo)記保護(hù)。研究表明,青錢柳富含三萜類、黃酮類、多糖類及微量元素等功能活性成分,具有降糖、降脂、抗腫瘤、抗氧化及提高免疫力等多種功能,是良好的天然保健食品資源[1-3]。研究已經(jīng)證實,大多數(shù)三萜化合物都具有藥理活性,如抗糖尿病[4]、抗腫瘤[5]、抗氧化[6]、抗炎[7]等,在醫(yī)藥和保健食品領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。三萜化合物是青錢柳中一類重要的活性物質(zhì),具有降糖、降壓等功能活性[8],目前關(guān)于此類物質(zhì)的研究報道較少。青錢柳葉三萜粗提物中含有多糖、蛋白質(zhì)、黃酮等雜質(zhì),純化難度較大。大孔樹脂吸附純化是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種新型純化方法,具有吸附容量大、再生簡單、穩(wěn)定可靠等諸多優(yōu)點(diǎn),是分離純化三萜類、黃酮類、多糖類等物質(zhì)的重要方法[9]。本研究以大孔樹脂吸附法對青錢柳三萜粗提物的純化進(jìn)行探討,旨在為青錢柳資源的深度開發(fā)利用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    青錢柳葉采自江西省修水縣,去除雜質(zhì)和枝桿后,常壓干燥,粉碎過60目篩備用。

    AB-8、DM130、HPD100、HPD722 大孔樹脂 滄洲寶恩吸附材料科技有限公司;D3520、D4020大孔樹脂 南開大學(xué)化工廠;熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所;所用化學(xué)試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    UV-754紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;HF-2.5B超聲循環(huán)提取機(jī) 北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;QT-1旋渦混合器 上海琪特分析儀器系統(tǒng)有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 三萜化合物檢測

    參照洪艷平[10]、凌慶枝[11]等的方法。檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制過程如下:精確吸取對照品熊果酸溶液(90μg/mL)200、400、600、800、1000、1200、1400、1800、2200μL,分別加入具塞試管,水浴揮干。分別加入50g/L香草醛-冰乙酸和高氯酸各0.3mL和1.0mL,混勻,70℃水浴15min,迅速冷卻后加入4.0mL冰乙酸,于550nm波長處測定吸光度。測定回歸方程為:y=0.0047x-0.0166,R2=0.9977,式中,y為吸光度,x為熊果酸量/μg。

    1.3.2 三萜化合物提取

    準(zhǔn)確稱量青錢柳葉干粉(60℃干燥至質(zhì)量恒定),石油醚脫脂(等體積脫脂2次),揮干石油醚,以65%乙醇超聲輔助提取30min,離心(3000r/min、10min),同條件二次提取,合并各級提取液,真空濃縮得三萜化合物粗提物。

    1.3.3 三萜粗提物純化工藝流程

    三萜粗提物水溶液→上大孔樹脂層析柱→蒸餾水洗柱→不同乙醇溶液梯度洗柱→收集目標(biāo)組分(以薄板層析,L-B顯色鑒定[12])→真空濃縮干燥→純化三萜化合物

    1.3.4 樹脂預(yù)處理

    按廠家說明書進(jìn)行處理。

    1.3.5 靜態(tài)吸附-解吸實驗

    1.3.5.1 靜態(tài)吸附實驗

    準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理后濾干水分的AB-8、DM130、HPD100、HPD722、D3520、D4020大孔樹脂各1g,置于磨口三角瓶中,各加入45mL已測定質(zhì)量濃度的三萜粗提物水溶液,置于恒溫?fù)u床中進(jìn)行吸附(115r/min,28℃),至上層液吸光度恒定時終止吸附,靜置取上清液測三萜化合物質(zhì)量濃度。

    比飽和吸附量(Qe)/(mg/g)=(吸附前質(zhì)量濃度-吸附后質(zhì)量濃度)×吸附液體積/樹脂質(zhì)量

    1.3.5.2 靜態(tài)解吸實驗

    將按1.3.5.1節(jié)吸附飽和的樹脂加入到60mL 95%的乙醇中,置于恒溫?fù)u床中進(jìn)行解吸(115r/min,28℃),至上層液吸光度恒定時終止解吸,靜置取上清液測三萜化合物質(zhì)量濃度。

    1.3.6 動態(tài)吸附-解吸實驗

    1.3.6.1 動態(tài)吸附實驗

    準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理后濾干水分的AB-8樹脂,濕法上柱,蒸餾水平衡后進(jìn)行動態(tài)吸附-解吸實驗。取一定質(zhì)量濃度的三萜粗提物水溶液,以1.25mL/min的流速上柱,每1BV為1單位收集流出液,測定其三萜類物質(zhì)含量,至流出液質(zhì)量濃度接近上柱液且基本恒定時停止上柱,以流出液體積為橫坐標(biāo)、三萜類物質(zhì)質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制動態(tài)吸附曲線。

    取等量三萜粗提物水溶液,分別以原液、2倍稀釋液、4倍稀釋液、8倍稀釋液以相同流速上柱,同條件洗脫,測定吸附純化后的三萜類物質(zhì)含量,以分析上柱液質(zhì)量濃度對吸附效果的影響。

    取等體積等質(zhì)量濃度三萜粗提物水溶液,分別以0.75、1.5、2.25、3.0mL/min的流速上柱,同條件洗脫,測定吸附純化后的三萜類物質(zhì)含量,以分析上柱流速對吸附效果的影響。

    1.3.6.2 動態(tài)解吸實驗

    準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理后濾干水分的AB-8樹脂,濕法上柱,蒸餾水平衡,以一定質(zhì)量濃度的三萜粗提物水溶液上柱,至流出液三萜類物質(zhì)質(zhì)量濃度為上柱液的1/5時停止上柱,10BV蒸餾水沖洗,再以10BV的40%、60%、80%、95%乙醇梯度洗脫,以高效鋁質(zhì)薄板層析,L-B顯色鑒定,比較各梯度洗脫液中三萜類物質(zhì)的種類。

    取以相同條件吸附的樹脂柱,以10BV蒸餾水沖洗,10BV 40%乙醇洗脫去雜,再分別以20BV 60%、80%、95%、100%乙醇進(jìn)行洗脫并測定洗脫液中三萜類物質(zhì)的含量,以確定洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)。

    吸附后完成沖洗的樹脂柱,40%乙醇洗脫去雜,再以95%乙醇洗脫,每1BV為1單位收集流出液,測定三萜類物質(zhì)含量,繪制洗脫曲線。以不同流速進(jìn)行洗脫,繪制洗脫曲線,以確定優(yōu)選洗脫流速。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 大孔樹脂靜態(tài)吸附性能比較及篩選

    大孔樹脂種類繁多,因極性、孔徑、比表面積不同而對吸附液中各組分的吸附作用有強(qiáng)有弱,解吸的難易也有區(qū)別。選擇合適的樹脂是大孔樹脂吸附純化的第一步,也是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究根據(jù)吸附純化的基本原理,選擇6種樹脂進(jìn)行實驗,其中D3520和D4020為非極性,AB-8、HPD100和HPD722為弱極性,DM130為中等極性,以靜態(tài)吸附法對樹脂進(jìn)行篩選。實驗結(jié)果(表1)表明:非極性的D3520和D4020對青錢柳三萜的吸附率較低,總回收率明顯低于弱極性和中等極性的樹脂;相對來說,AB-8具有較好的吸附、解吸性能,比飽和吸附量為77.49mg/g,解吸率為85.44%,總回收率可達(dá)72.01%。因此,本實驗選擇AB-8樹脂進(jìn)行下一步的動態(tài)吸附-解吸實驗。

    表1 大孔樹脂靜態(tài)吸附性能比較Table 1 Comparison on static adsorption and desorption capabilities of different types of macro-porous resins

    2.2 AB-8樹脂動態(tài)吸附曲線

    圖1 AB-8樹脂動態(tài)吸附曲線Fig.1 Dynamic adsorption curve of AB-8 resin

    取6.070mg/mL的三萜粗提物水溶液,以1.25mL/min的流速上柱,每1BV為1單位收集流出液繪制動態(tài)吸附曲線,結(jié)果如圖1所示。當(dāng)上柱體積為3BV時,流出液的質(zhì)量濃度為1.208mg/mL,接近上柱液質(zhì)量濃度的1/5,達(dá)到了泄漏點(diǎn)質(zhì)量濃度。因此,AB-8樹脂吸附純化6.070mg/mL青錢柳葉三萜粗提物水溶液的處理能力為3BV。當(dāng)上柱體積達(dá)到12BV后,流出液的質(zhì)量濃度趨于平穩(wěn),可以認(rèn)為達(dá)到了樹脂的飽和吸附點(diǎn)。為充分利用樹脂的吸附能力,可采用循環(huán)上柱或多柱串聯(lián)的形式純化三萜類物質(zhì)。

    2.3 上樣速度對吸附的影響

    圖2 不同上樣流速時的吸附效果Fig.2 Effect of sample solution flow rate on adsorption efficiency of AB-8 resin

    不同的上樣速度,目標(biāo)物與樹脂的接觸時間不同,吸附量也因此會發(fā)生變化。由圖2可知,隨著上樣速度的增大,三萜類物質(zhì)的吸附量呈下降的趨勢,上樣速度為0.75mL/min時吸附率較高。樹脂對目標(biāo)物的吸附需要一個擴(kuò)散和接觸的過程,上樣速度過快,目標(biāo)物與樹脂還未來得及充分接觸就已下移到下一個吸附層面,以致于很快通過層析柱流出柱外,這樣就無法形成有效的吸附,同時造成譜帶的擴(kuò)散,影響分離效果。因此,以AB-8樹脂純化青錢柳葉三萜類物質(zhì)時,應(yīng)降低上樣速度以提高吸附率,但上樣速度太低會使得純化效率很低,實際應(yīng)用時可適當(dāng)提高上樣速度。

    2.4 上樣質(zhì)量濃度對吸附的影響

    圖3 不同上樣質(zhì)量濃度時的吸附效果Fig.3 Effect of sample solution concentration on adsorption efficiency of AB-8 resin

    實驗結(jié)果(圖3)表明,隨著上樣質(zhì)量濃度的提高,三萜類物質(zhì)的吸附率呈先升后降之勢,以2.44mg/mL的吸附效果最好。從理論上講,上樣質(zhì)量濃度越高,吸附率應(yīng)該越高,因為質(zhì)量濃度差越大越有利于擴(kuò)散,但本實驗結(jié)果卻表明,在較低的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)增加質(zhì)量濃度時吸附率升高,而大于一定質(zhì)量濃度時增加質(zhì)量濃度反而會降低吸附率,主要原因可能是上樣液質(zhì)量濃度太高時,黏度較大,會阻礙目標(biāo)物擴(kuò)散,從而降低吸附率。高俠等[13]、李淑珍等[14]也報道了隨著上樣質(zhì)量濃度增加目標(biāo)物吸附率先升后降的實驗結(jié)果,馮穎等[15]認(rèn)為,引起高質(zhì)量濃度時吸附率下降的原因可能是雜質(zhì)的競爭性吸附作用。

    2.5 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇解吸液的解吸效果

    圖4 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的解吸效果Fig.4 Effect of ethanol concentration on desorption efficiency of AB-8 resin

    結(jié)果(圖4)表明,40%乙醇洗脫液中基本上不含三萜類物質(zhì),而大部分吸附在樹脂上的色素可被40%乙醇洗脫下來,因而三萜類物質(zhì)與色素可得到較好的分離。60%、80%、95%和100%四種體積分?jǐn)?shù)的乙醇解吸液中,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高解吸率也呈現(xiàn)出升高的趨勢,其中95%乙醇、100%乙醇的解吸率明顯高于其他體積分?jǐn)?shù),解吸所得目標(biāo)物的純度差別不大。因此,從解吸率的角度考慮,應(yīng)選用100%的乙醇作為洗脫劑,如果考慮到成本問題,也可以選用95%乙醇。

    2.6 動態(tài)解吸曲線

    圖5 AB-8樹脂動態(tài)解吸曲線Fig.5 Dynamic desorption curve of AB-8 resin

    結(jié)果(圖5)表明,以95%乙醇洗脫,質(zhì)量濃度峰值出現(xiàn)在3~6BV,且峰形較尖、峰寬較小,其中以4BV時質(zhì)量濃度最高,10BV后三萜質(zhì)量濃度已經(jīng)很小,大部分三萜在前10BV時已解吸。因此,10BV為合理的洗脫劑用量。

    2.7 不同洗脫流速的洗脫效果

    圖6 不同解吸流速時的解吸曲線Fig.6 Desorption curve at different flow rates

    選擇0.75、1.50、2.25、3.00mL/min四種流速進(jìn)行動態(tài)解吸實驗,結(jié)果(圖6)表明:隨著洗脫流速的增加,解吸量呈下降的趨勢;0.75mL/min與1.50mL/min的解吸量差異不明顯,但二者均顯著高于2.25mL/min和3.00mL/min;流速越低,洗脫峰質(zhì)量濃度越高;10BV后曲線均較為平坦。綜合考慮洗脫率和洗脫效率,1.5mL/min的洗脫流速較為合理。

    2.8 純化后三萜化合物的純度

    青錢柳葉三萜粗提物,經(jīng)AB-8大孔樹脂吸附、蒸餾水沖洗、40%乙醇沖洗去雜、95%乙醇洗脫、真空濃縮干燥,得到的純化三萜化合物為棕黃色粉末或片狀物,有光澤,純度可達(dá)44.30%。

    3 結(jié) 論

    3.1 所選的6種供試大孔樹脂中,AB-8對青錢柳葉三萜化合物具有較好的靜態(tài)吸附、解吸性能,比飽和吸附量為77.49mg/g,解吸率為85.44%,總回收率可達(dá)72.01%,適用于青錢柳葉三萜類物質(zhì)的純化。

    3.2 采用AB-8樹脂動態(tài)吸附純化青錢柳葉三萜化合物時,對6.070mg/mL粗提物水溶液的處理能力為3BV;為獲得較好的吸附效果,應(yīng)以較低流速上樣;隨著上樣質(zhì)量濃度的提高,三萜類物質(zhì)的吸附率呈先升后降之勢,2.44mg/mL的吸附效果較好;95%乙醇可獲得較好的解吸效果,10BV為合理的解吸劑用量;洗脫流速越低,效果越好,綜合考慮洗脫效率,1.5mL/min較為合理。

    3.3 經(jīng)AB-8樹脂純化后的青錢柳葉三萜化合物為棕黃色粉末或片狀物,有光澤,純度可達(dá)44.30%。

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    Purification of Triterpenoids fromCyclocarya paliurusLeaves by Macro-porous Resin Adsorption

    YIN Zhong-ping1,2,SHANGGUAN Xin-chen1,2,*,ZHANG Yue-hong2,LI Dong-ming2,WU Shao-fu2,CHEN Ji-guang2
    (1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China;2. Laboratory of Plant Resources Exploitation and Utilization, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

    In order to obtain triterpenoids with high purity fromCyclocarya paliurusleaves, macro-porous resin was used for purification. Results indicated that macro-porous resin revealed a static absorption mode. AB-8 resin had good adsorption capability on triterpenoids fromCyclocarya paliurusleaves, and its adsorption capacity, desorption rate and total recovery rate were 77.49 mg/g, 85.44% and 72.01%, respectively. Dynamic adsorption and desorption experiments of AB-8 resin suggested that the increasing flow rate of sample solution could result in the decrease of adsorption rate, and the increasing sample amount in resin could result in a pattern of initial increase and final decline for adsorption rate. A better elution efficiency was observed at the concentration of 95% ethanol, and 10 BV was reasonable dosage. Both peak concentration and desorption rate were declined with the increasing flow rate of eluent. The best flow rate was 1.5 mL/min. The purity of triterpenoids purified by AB-8 macro-porous resin was 44.30%.

    Cyclocarya paliurus;total triterpenoids;macro-porous resin;purification

    TQ028.15

    A

    1002-6630(2011)06-0061-05

    2010-05-17

    江西省科技支撐計劃項目(2009BSB09100);江西省自然科學(xué)基金項目(2007GZN0214)

    尹忠平(1971—),男,講師,博士研究生,主要從事食品化學(xué)與營養(yǎng)研究。E-mail:yinzp2008@yahoo.com.cn

    *通信作者:上官新晨(1962—),男,教授,博士,主要從事植物資源開發(fā)與利用研究。E-mail:shangguanxc_818@sina.com

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