光系統(tǒng)Ⅱ超分子復(fù)合物的放氧活性分析

劉 坤, 孫瑞雪, 趙 晨, 楊春虹

1.中國科學(xué)院植物研究所光生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093

2.中國科學(xué)院研究生院，北京100049

光系統(tǒng)Ⅱ超分子復(fù)合物的放氧活性分析

劉 坤1,2, 孫瑞雪1,2, 趙 晨1,2, 楊春虹1

1.中國科學(xué)院植物研究所光生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093

2.中國科學(xué)院研究生院，北京100049

以高等植物大量捕光色素蛋白復(fù)合物 (major light harvesting complexⅡ,LHCⅡb)對光系統(tǒng)Ⅱ (photosystemⅡ,PSⅡ)放氧活性的影響為研究對象，從豌豆類囊體膜中分步提取出三種PSⅡ蛋白復(fù)合物，結(jié)合電泳和光譜分析，鑒定出三種復(fù)合物的主要區(qū)別是LHCⅡb含量不同。對于三種PSⅡ色素蛋白復(fù)合物在不同光質(zhì)和光強(qiáng)下放氧速率變化的測定結(jié)果表明，三種復(fù)合物的放氧速率均存在光飽和點(diǎn)。含有1～2個(gè)LHCⅡb三體的粗核心提取物的放氧活性和幾乎不含LHCⅡb的純核心的放氧活性一致，但是它們的放氧活性都遠(yuǎn)低于含有5～6個(gè)LHCⅡb三體的富含PSⅡ顆粒的膜片。說明PSⅡ超分子體系在少于2個(gè)外周天線時(shí)不能發(fā)揮正常的光化學(xué)活性。

光系統(tǒng)Ⅱ；大量捕光色素蛋白復(fù)合物；放氧速率

引 言

光系統(tǒng)Ⅱ (photosystemⅡ,PSⅡ)吸收太陽光能，利用所吸收的太陽能，催化水的氧化裂解并產(chǎn)生氧氣，是地球上所有生物賴以生存的條件[1,2]。在高等植物中，PSⅡ主要以二聚體形式存在，每個(gè)單體由至少27～28個(gè)亞基組成[3]，它們可以分為核心復(fù)合物和外周天線系統(tǒng)。核心復(fù)合物主要包括：1)D1和D2蛋白，結(jié)合有反應(yīng)中心P680和電子傳遞鏈的所有輔因子；2)內(nèi)周天線蛋白CP43和CP47，結(jié)合葉綠素a(chlorophyll,Chl a)分子；3)位于腔側(cè)的放氧復(fù)合物 (oxygen evolution complexe,OEC)；4)若干低分子量的亞基。對藍(lán)細(xì)菌PSⅡ高分辨率 (2.9 ?)晶體結(jié)構(gòu)解析表明，每個(gè)PSⅡ結(jié)合35個(gè)Chl a分子、2個(gè)脫鎂葉綠素 (pheophytin,Pheo)分子和12個(gè)β胡蘿卜素分子 (β-carotenoid)[4]。外周天線系統(tǒng)由Lhcb多基因家族編碼的6種蛋白與色素形成的復(fù)合物組成[5]，它們結(jié)合的Chl a、Chl b和葉黃素的比值各不相同。其中，大量天線復(fù)合物 (major light harvesting chlorophyll a/b complex,LHCⅡb)，是由Lhcb1-3基因編碼的產(chǎn)物組成的異質(zhì)三聚體。另外三個(gè)亞基CP29(Lhcb4)、CP26(Lhcb6)和CP24(Lhcb5)則以單體的形式存在[6]。PSⅡ的外周天線系統(tǒng)是類囊體膜上最重要的、也是最富集的蛋白系統(tǒng)。

外周天線最主要的作用就是捕獲光能，將激發(fā)能傳遞到反應(yīng)中心。為了避免在強(qiáng)光條件下過剩的激發(fā)能對光合色素蛋白復(fù)合體超分子體系產(chǎn)生光破壞，外周天線還可以將PSⅡ中過剩的激發(fā)能以熱的形式耗散掉。從冷凍電鏡和原子力顯微鏡得到的信息表明，核心復(fù)合物可以和不同數(shù)量的外周天線系統(tǒng)組成超分子復(fù)合體。目前廣泛接受的是C2S2M2模型，即兩個(gè)LHCⅡb三體 (trimer S)在CP43和CP26側(cè)緊密地貼近一個(gè)核心復(fù)合物二聚體(C2)，另兩個(gè)LHCⅡb三體 (trimer M)與CP29和CP24中度結(jié)合[7]。植物PSⅡ?qū)τ贚HCⅡ的親和力隨著外界光強(qiáng)的波動而發(fā)生變化，通過LHCⅡ磷酸化、形成聚集體或者葉黃素循環(huán)等機(jī)制來實(shí)現(xiàn)PSⅡ-LHCⅡ超分子體系的能量平衡以及光保護(hù)等功能[8～10]。而PSⅡ-LHCⅡ超分子體系的組成變化對植物PSⅡ放氧活性有何影響，目前沒有文獻(xiàn)給予證實(shí)。

材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料

豌豆 (Pisum sativum L.)播種在一倍營養(yǎng)土搭配兩倍蛭石的基質(zhì)上，生長溫度20℃，濕度50%，光周期為16 h光照(150 μmol/m2·s)，8 h黑暗。連續(xù)培養(yǎng)14 d后收獲。

PSⅡ核心復(fù)合物的分離純化

類囊體膜的制備參照改良的Kuhlbrandt方法[11]進(jìn)行。豌豆苗葉片經(jīng)過搗碎，除殘?jiān)?。離心得到的沉淀用清洗液 (0.2 mol/L蔗糖、0.1 mol/L NaCl、50 mmol/L Tricine、5 mmol/L MgCl2,pH 8.0)重懸，再經(jīng)離心。沉淀懸浮于脹破液 (20 mmol/L MES-NaOH、5 mmol/L MgCl2、15 mmol/L NaCl,pH 6.5)中冰浴靜置20 min，離心。沉淀再重懸，色素濃度調(diào)整至3 mg/mL液氮速凍，-80℃保存。以上所有提取步驟都在4℃和暗中〔操作時(shí)采用綠光(波長520～560nm)照明，光強(qiáng)小于5 μmol/m2·s〕進(jìn)行。

在類囊體膜的基礎(chǔ)上，依照Ghanotakis等的方法提取富含PSⅡ顆粒的類囊體膜 (Photosystem Ⅱ enriched membranes,BBY)[12]。向色素濃度為3 mg/mL的類囊體膜中滴加半倍體積的10%Triton X-100，攪拌增溶30 min，離心40 min(35000 g)。用保存液〔0.4 mol/L 蔗糖、25 mmol/L MES-NaOH(pH 6.5)、10 mmol/L NaCl、5 mmol/L CaCl2、0.5 mol/L甜菜堿〕重懸沉淀，離心收集BBY。以上所有提取步驟都在4℃和暗中進(jìn)行。

按照Hankamer等[13]的方法提取PSⅡ粗核心 (PSⅡ crude core,CC)以及PSⅡ純核心(PSⅡ core)。將BBY顆粒用 346 mmol/L的辛基葡萄糖苷 (n-octyl β-D-glucopyranoside，OG)增溶，離心10 min(48400 g)。上清液經(jīng)過稀釋后再次離心1 h(150000 g，4℃)，所得沉淀即為粗核心。粗核心經(jīng)過50 mmol/L十二烷基麥芽糖苷 (n-Dodecyl β-D-pyranoside,DDM)增溶后，通過蔗糖梯度離心 (90000 g，5 h)，分離出PSⅡ核心二聚體。以上所有提取步驟都在4℃和暗中進(jìn)行。

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

按照Hunt等[14]的方法，制備含有6 mol/L尿素的聚丙烯酰胺分離膠 (15%T，4%C)和濃縮膠 (5%T，4%C)。將樣品與樣品緩沖液 〔12%SDS(w/v)，6% 巰基乙醇，30% 甘油 (w/v)，0.05%考馬斯亮藍(lán)G250，150 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)〕混合均勻，上樣前在40℃水浴1 h。

葉綠素濃度測定

將10 μl的樣品溶于2 ml的80%丙酮，離心去除沉淀。測定750、663.6和646.6 nm下的吸光度。按照Porra[15]的公式，計(jì)算出Chl a和Chl b的濃度。

吸收光譜和77 K熒光光譜

吸收光譜用Shimadzu UV-2550雙光束分光光度計(jì) (島津，東京)在室溫下進(jìn)行檢測，掃描速率為100 nm/min，分辨率為0.5 nm。樣品色素濃度為10 μg/mL。

樣品的熒光發(fā)射光譜用Hitachi F-7000熒光分光光度計(jì) (日立，東京)在77 K條件下檢測。激發(fā)光選用波長為436 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫分別是10 nm和5 nm。樣品色素濃度為 1.5 μg/mL。

液相放氧速率測定

樣品的放氧活性以單位時(shí)間內(nèi)、單位質(zhì)量Chl a(核心復(fù)合物中的Chl a)的放氧量(μmol O2/mg Chl aPSⅡcore·h)表示。放氧量用Clark型氧電極 (漢莎科學(xué)儀器，諾福克)于25℃水浴下進(jìn)行測定，電子受體2,6-二氯對苯醌 (2,6-dichloro-p-benzoquinone,2,6-DCBQ)的濃度為0.5 mmol/L，樣品濃度為10 μg Chl/mL。光源采用100 W、無紫外波段的OSRAM鹵鎢燈，通過光導(dǎo)，以相等光斑大小導(dǎo)入放氧反應(yīng)界面。

結(jié) 果

提取并鑒定PSⅡ色素蛋白復(fù)合物

圖1所示為三種不同的PSⅡ提取物的電泳結(jié)果，從中可以分辨出三種復(fù)合物的亞基組成。三種復(fù)合物的主要差別在于外周天線系統(tǒng)的含量不同，特別是大量天線LHCⅡb，表現(xiàn)出由富含PSII顆粒的類囊體膜 (BBY)、PSⅡ粗核心(CC)、向PSⅡ核心逐漸減低的過程。

圖1 三種PSⅡ提取物的SDSPAGE電泳圖譜 標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白標(biāo)簽的分子量在左側(cè)標(biāo)出。主要蛋白質(zhì)條帶在右邊標(biāo)出Fig.1 SDS-PAGE profileofthe three types of PSⅡpreparations Molecular weights(kDa)of the protein marker bands are given in the left margin

圖2表示三種樣品的室溫吸收光譜。BBY的吸收光譜呈現(xiàn)4個(gè)主要的吸收峰 (紅光區(qū)為650和675 nm，藍(lán)光區(qū)為435和470 nm)，435和675 nm附近的吸收峰對應(yīng)BBY的Chl a的吸收，而470和650 nm附近的兩個(gè)主峰主要對應(yīng)于結(jié)合在LHCⅡb上的Chl b分子的吸收峰。CC或者PSⅡ核心的吸收光譜在435和675 nm附近的吸收峰與BBY的相應(yīng)的吸收峰相對應(yīng)，而在Chl b分子的吸收峰附近(470和650 nm)的吸收大大低于BBY，特別是PSⅡ核心在這一區(qū)域幾乎沒有吸收峰。這一結(jié)果與圖1的結(jié)果相對應(yīng)，BBY含有最高量的LHCⅡb組分，而CC或者PSⅡ核心的LHCⅡb含量遞減。

我們根據(jù)Porra[15]的計(jì)算方法測定出BBY中Chl a/Chl b為2，CC中Chl a/Chl b為4.22，PSⅡ核心中Chl a/Chl b為22.8。前人的結(jié)果表明：LHCⅡb[16,17]、CP29[18]、CP26[18]和CP24[19]中的Chl a/Chl b分別是1.33、3.4、2.5和1.17。而核心復(fù)合物是沒有Chl b的，這也說明三種提取物所含的LHCⅡb是逐漸減少的。

圖3所示為由436 nm波長激發(fā)不同PSⅡ色素蛋白復(fù)合物提取物的熒光發(fā)射光譜?？梢钥闯?，在最大發(fā)射峰歸一化后，最大熒光發(fā)射峰位從BBY的683.6 nm紅移到CC的685.8 nm，再到PSⅡ核心的687.6 nm。放氧速率的變化

圖2 三種PSⅡ提取物的室溫吸收光譜 按10 μg Chl/mL的總?cè)~綠素量測定。然后在Qy區(qū)最大吸收值處歸一化Fig.2 Room temperature absorption spectra of three types of PSⅡpreparation with varying contents of LHCIIb The Chl concentration is 10 μg Chl/mL.The spectra are normalized to the maximum absorption in the Qyregion

圖3 三種PSⅡ提取物的77 K熒光發(fā)射光譜 (激發(fā)光為436 nm) 葉綠素的濃度為1.5 μg Chl/mL。插圖表示歸一化后各個(gè)提取物最大發(fā)射峰峰位的紅移Fig.3 77 K fluorescence emission spectra of the three types of PSⅡ preparations The spectra were measured upon excitation at 436 nm(Chl a).The Chl concentration was 1.5 μg Chl/mL. Inset displays the red shift of maximum peaks from BBY to PSⅡcore

為了分析不同PSⅡ提取物的功能，我們測量了BBY、CC和PSⅡ核心在不同光強(qiáng)條件下的放氧速率。

放氧速率與放氧復(fù)合物的數(shù)量有直接關(guān)系。通過對三種樣品的分析已知，不同提取物的主要區(qū)別是PSⅡ超分子體系所結(jié)合的LHCⅡb數(shù)量的不同。我們測定出BBY中Chl a/Chl b為2，CC中Chl a/Chl b為4.22，PSⅡ核心中Chl a/Chl b為22.8，而LHCⅡb中Chl a/Chl b等于1.33，再結(jié)合三種樣品各自的Chl a/Chl b，計(jì)算各種復(fù)合物中純核心所結(jié)合的Chl a在總?cè)~綠素中的比例。根據(jù)這個(gè)比例，計(jì)算出在放氧復(fù)合物數(shù)量一致時(shí)，三種復(fù)合物各自的放氧速率，得到圖4。

圖4 三種PSⅡ提取物的放氧速率隨光強(qiáng)的變化 每個(gè)測量值表示為三次獨(dú)立測量的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。放氧速率以等量核心復(fù)合物Chl a計(jì)算Fig.4 Light dependent changes of oxygen evolution rates of the three types of PSⅡpreparations The results are expressed as x±s of three individual experiments.The values are calculated based on the amount of Chl a in PSII core complex

圖4 表示不同樣品在不同光強(qiáng)條件下的放氧速率，各樣品的放氧曲線均存在光飽和點(diǎn)。在達(dá)到飽和光強(qiáng)之前，放氧速率隨光強(qiáng)增加呈現(xiàn)近似線性上升的趨勢。在光強(qiáng)達(dá)到飽和后，放氧速率的增加減慢，最后達(dá)到最大值。

為了表征不同的PSⅡ提取物在達(dá)到飽和光強(qiáng)之前的放氧速率與光強(qiáng)變化的數(shù)量關(guān)系，我們對各組測量點(diǎn)進(jìn)行了二次函數(shù)擬合。如圖4所表示，我們得到BBY、CC和PSⅡ核心的三個(gè)擬合函數(shù)，分別是：y=1.479x-0.00021x2、y=0.387x-0.000048x2和 y=0.423x-0.000053x2。根據(jù)所得函數(shù)，在 3 521 μmol/m2·s光強(qiáng)下，BBY的最大放氧速率為2604 μmol O2/mg Chl aPSⅡcore·h，和所測數(shù)值一致。而CC和PSⅡ核心根據(jù)函數(shù)計(jì)算的最大放氧分別為 780 和 844 μmol O2/mg Chl aPSⅡcore·h，分別出現(xiàn)在 4031 和 3991 μmol/m2·s光強(qiáng)處，與測量結(jié)果有很好的吻合。計(jì)算三個(gè)函數(shù)的一階導(dǎo)數(shù)，得到BBY、CC和PSⅡ核心的放氧速率隨光強(qiáng)增強(qiáng)的變化率，分別是：dy/dx=1.479-0.00042x、dy/dx=0.387-0.000096x和dy/dx=0.423-0.000106x。從這一計(jì)算可以看出，在低光強(qiáng)時(shí)，放氧速率隨光強(qiáng)增強(qiáng)的變化率近似于常數(shù)。CC和PSⅡ核心隨著光強(qiáng)增加而上升的速率比較接近 (分別為0.387和0.423)，而BBY放氧活性的上升速率明顯大于CC和PSⅡ核心 (1.479)。從圖4中還可以看出，隨著光強(qiáng)增加，BBY不僅放氧速率上升較快，而且在同一光強(qiáng)下具有最高的放氧能力，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于CC或者PSⅡ核心的放氧能力。

討 論

PSⅡ是進(jìn)行光合作用光反應(yīng)的原初反應(yīng)的場所，是直接決定光合作用光反應(yīng)效率的關(guān)鍵部位。為了高效率地吸收和傳遞光能，植物經(jīng)過30億年的進(jìn)化，發(fā)展了非常復(fù)雜的捕光天線系統(tǒng)。天線系統(tǒng)怎樣和核心復(fù)合物結(jié)合在一起？以怎樣的葉綠素通道把激發(fā)能傳遞到反應(yīng)中心？為適應(yīng)環(huán)境中光強(qiáng)的變化，天線系統(tǒng)和核心復(fù)合物之間保持怎樣的數(shù)量關(guān)系？雖然已經(jīng)有大量的研究闡明PSⅡ核心復(fù)合物可以和外周天線LHCⅡb組成多種不同的超分子體系[20,21]，但是，這些不同的超分子體系的功能如何變化，到現(xiàn)在還沒有得到系統(tǒng)的研究。本文提取三種不同LHCⅡb含量的PSⅡ復(fù)合物，主要通過測定它們不同光強(qiáng)下的放氧速率，探討了PSⅡ超分子體系中LHCⅡb的結(jié)合量對于PSⅡ反應(yīng)中心功能以及放氧復(fù)合體活性的影響。

對于三種樣品，均出現(xiàn)飽和，且飽和光強(qiáng)相同。PSⅡ在達(dá)到飽和值之前，其放氧活性和光強(qiáng)呈線性相關(guān)。就PSⅡ自身而言，限制放氧速率的因素是兩方面的，其一是光能吸收和傳遞存在效率限值；其二是反應(yīng)中心電荷分離后，在體內(nèi)需要完整的電子傳遞鏈，在體外需要依賴人工電子受體。這種電子載體是一種在PSⅡ外擴(kuò)散的物質(zhì)，其接受電子的效率在體外受擴(kuò)散率控制，與濃度相關(guān)，在體內(nèi)受到膜和膜蛋白的區(qū)域化限制[22]。

從不同PSⅡ復(fù)合物的熒光發(fā)射光譜可以看出，三種復(fù)合物各自的放氧活性不同，相應(yīng)于不同的熒光發(fā)射最大峰值，從Chl a的熒光發(fā)射光譜中能夠看到，最大發(fā)射峰從BBY的683.6 nm紅移到CC的685.8 nm，再紅移到PSⅡ核心的687.6 nm，表明具備完整外周天線的BBY可以將吸收的光能更多地激發(fā)傳遞到反應(yīng)中心。而隨著外周天線的減少，峰位紅移，表明內(nèi)周天線CP43和CP47的熒光發(fā)射增加，反應(yīng)中心的熒光發(fā)射減少。這一現(xiàn)象說明了外周天線的作用不僅僅是吸收光能，并將產(chǎn)生的激發(fā)能傳遞到反應(yīng)中心，而且，外周天線的結(jié)合也影響到內(nèi)周天線和反應(yīng)中心間的能量傳遞，最終影響到反應(yīng)中心的光化學(xué)反應(yīng)和放氧復(fù)合物功能。

根據(jù)每個(gè)LHCⅡb單體中有8個(gè)Chl a和6個(gè)Chl b[16]，純核心復(fù)合物二體中Chl a=70[4]，結(jié)合我們提取的三種復(fù)合物的Chl a/Chl b(表1)，我們可以得出BBY中每個(gè)二體周圍平均有5.83個(gè)三體LHCⅡb，CC中每個(gè)二體周圍平均有1.36個(gè)三體LHCⅡb，而PSⅡ核心中幾乎沒有LHCⅡb。這與Dekker等人提出的C2S2M2模型[7]相吻合，即核心復(fù)合物與其外周天線的結(jié)合強(qiáng)度是不同的。本文所提的BBY是LHCⅡb更為充裕的狀態(tài)[23]，其應(yīng)以C2S2M2超分子體為主，并且還結(jié)合了更為松散的LHCⅡb三體或單體。而PSⅡ粗核心在提取的過程中，中度結(jié)合的LHCⅡb三體被去垢劑剔除，僅留下緊密結(jié)合的LHCⅡb。

觀察放氧速率隨光強(qiáng)變化的增加率，我們發(fā)現(xiàn)CC和PSⅡ核心在相同光質(zhì)條件下的增長率幾乎一致?？梢姡诤诵耐饨Y(jié)合1～2個(gè)LHCⅡb，其傳遞的光能對于放氧復(fù)合物的光化學(xué)反應(yīng)沒有明顯的作用。我們的觀察與Caffarri等人[24]對于用溫和去污劑處理擬南芥類囊體膜，分離出的不同組合的PSⅡ-LHCⅡ超分子體的結(jié)果不一致，這是由于他們只是在非常低的光強(qiáng) (180 μmol/m2·s)條件下作的相同觀察，其測定放氧速率的光強(qiáng)較低，故并未反映出這些超分子體之間放氧活性的差異。

綜上所述，我們可以提出結(jié)論，LHCⅡ-PSⅡ超分子體系的5個(gè)以上的外周天線 (BBY)有助于提高PSⅡ中的能量傳遞效率和放氧效率，這一體系所結(jié)合的外周天線少于2個(gè)，則不能發(fā)揮正常的光化學(xué)活性。

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Analysis of Oxygen Evolution of PhotosystemⅡSuper-Complexes

LIU Kun1,2,SUN Ruixue1,2,ZHAO Chen1,2,YANG Chunhong1
1.Institute of Botany,Key Laboratory of Photobiology,Chinese Academy of Science,Beijing 100093,China；
2.Graduate School of the Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China

Communication by editorial board members(LIU Pingsheng)

This work was supported by grants from The National Natural Science Foundation of China(71070212),The"973"Program(2009cb118501)

Oct 30,2010 Accepted:Dec 3,2010

YANG Chunhong,Tel:+86(10)62836252,Fax:+86(10)62836219,E-mail:yangch@ibcas.ac.cn

Three different types of photosystem Ⅱ (PSⅡ)preparations,PSⅡ enriched membranes,PSⅡcrude core particles and PSⅡcore complexes,were isolated from thylakoid membranes of pea seedlings.The structural analysis showed that the main difference among the preparations was the size of the antenna cross section in the PSⅡ macrostructure.The functional analysis to different PSⅡ preparations showed that the oxygen evolution from PSⅡ enriched membranes,containing 5～6 LHCⅡb trimers per PSⅡ dimmer,was about three times higher than those of PSⅡ particle preparation(containing 1～2 LHCⅡb)and the PSⅡcorecomplexes(containingalmostnoLHCⅡb). ComparingthedifferencesamongthethreePSⅡpreparations reveals that the attachment of more than 2 trimeric LHCⅡb is the prerequisite for the perfect functionality of PSⅡsupercomplexes.

Photosystem Ⅱ;Major light-harvesting chlorophyⅡ a/b complexe of photosystem Ⅱ;Oxygen evolution rate

本文通過“綠色通道”投稿 (推薦編委：劉平生)

2010-10-30；接受日期：2010-12-03

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(71070212)，“973”計(jì)劃項(xiàng)目(2009cb118501)

楊春虹，電話：(010)62836252，傳真:(010)62836219，E-mail：yangch@ibcas.ac.cn

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