以微流體技術(shù)構(gòu)建紋狀體神經(jīng)元流道圖案的形態(tài)學(xué)研究

羅亞黎， 高 侃， 徐群淵

首都醫(yī)科大學(xué)北京神經(jīng)科學(xué)研究所，北京市神經(jīng)再生修復(fù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，教育部神經(jīng)變性病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100069

以微流體技術(shù)構(gòu)建紋狀體神經(jīng)元流道圖案的形態(tài)學(xué)研究

羅亞黎， 高 侃， 徐群淵

首都醫(yī)科大學(xué)北京神經(jīng)科學(xué)研究所，北京市神經(jīng)再生修復(fù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，教育部神經(jīng)變性病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100069

在以微流體技術(shù)加工的聚乙烯亞胺 (polyethyleneimine，PEI)及層粘連蛋白 (laminin，LN)混合物材料上，培養(yǎng)紋狀體神經(jīng)元圖案式黏附、生長(zhǎng)，為制備神經(jīng)芯片打好基礎(chǔ)。以微流體印刷方法在硅片上微加工四種不同的黏附底物：LN、帶正電荷的多聚賴氨酸 (poly-L-lysine，PLL)、PEI和PEI+LN混合物。體外分離培養(yǎng)新生乳鼠紋狀體神經(jīng)元，評(píng)價(jià)神經(jīng)元在不同圖案化黏附底物上的黏附存活、突起生長(zhǎng)狀態(tài)及形成流道圖案的差異；在PEI+LN混合物圖案中觀察不同線間距對(duì)構(gòu)建神經(jīng)元流道圖案的效果。結(jié)果表明，在PEI、PLL及PEI+LN圖案表面生長(zhǎng)的神經(jīng)元數(shù)量明顯大于LN組；神經(jīng)元在PEI+LN混合底物上與單純PEI、LN、PLL相比更能形成完整的流道圖案，在流道間距處于150 μm及200 μm時(shí)更為清晰。研究證實(shí)，通過(guò)微流體微加工后，由PEI與LN混合形成的粘附底物經(jīng)優(yōu)化流道圖案規(guī)格后，能有效地構(gòu)建神經(jīng)元流道圖案，有利于制備神經(jīng)芯片。

微流體技術(shù)；聚乙烯亞胺；細(xì)胞培養(yǎng)

引 言

神經(jīng)芯片研究，即是在體外圖案化培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞，以研究、控制特定神經(jīng)細(xì)胞的連接和功能行為，在細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)研究以及組織工程學(xué)、細(xì)胞傳感、藥物篩選和創(chuàng)傷治療等應(yīng)用領(lǐng)域都有重要學(xué)術(shù)意義和應(yīng)用價(jià)值[1,2]。神經(jīng)芯片研究的關(guān)鍵是要在體外建立能和微電子設(shè)備相匹配并具有功能的圖案化神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，其首先要解決的問(wèn)題是神經(jīng)元須按特定的位置黏附和生長(zhǎng)在基底材料上。在這方面，近年來(lái)發(fā)展的軟刻技術(shù)為此提供了良好的技術(shù)平臺(tái)。所謂軟刻技術(shù)，即是通過(guò)化學(xué)固定方法把利于細(xì)胞附著的偶聯(lián)多肽、大分子聚合物等通過(guò)高分子聚合物 〔如聚二甲基硅氧烷 (poly-dimethylsiloxine，PDMS)〕按光刻微加工圖案印刷到基底材料上[3]，使神經(jīng)細(xì)胞按照?qǐng)D案提供的特定空間分布生長(zhǎng)并形成突觸聯(lián)系。同時(shí)，通過(guò)PDMS軟印章和基底形成的微流體通道，以滋養(yǎng)在其表面生長(zhǎng)的神經(jīng)細(xì)胞，使其實(shí)現(xiàn)微流體圖案化。

常選擇用于印刷的生物大分子主要有層粘連蛋白 (laminin，LN)，它是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(extracellular matrix，ECM)中的糖蛋白，對(duì)各種細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)和分化都起重要作用；在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中則有調(diào)節(jié)神經(jīng)元遷移和軸突定向生長(zhǎng)的作用。但是，涉及LN的神經(jīng)細(xì)胞粘附作用機(jī)制中需要血清蛋白的某些成分參與[4]，而構(gòu)建高純度的圖案化神經(jīng)元卻要求無(wú)血清的培養(yǎng)環(huán)境 (否則細(xì)胞易聚集成團(tuán)而脫落)，單純使用存在一定難度。除LN外，帶有正電荷的物質(zhì)，如多聚賴氨酸 (poly-l-lysine，PLL)，因其表面帶有大量呈正電效應(yīng)的氨基基團(tuán)，也可以用作吸引帶有負(fù)電荷物質(zhì)的細(xì)胞黏附劑。使用PLL的缺點(diǎn)在于，其多肽骨架在長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過(guò)程中容易水解，造成培養(yǎng)神經(jīng)元從基底材料表面脫落。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，一種帶有正電荷的新型多聚體聚乙烯亞胺 (polyethy-leneimine，PEI)，作為生物材料促進(jìn)某些細(xì)胞黏附的能力要比PLL更強(qiáng)[5,6]；同時(shí)，PEI經(jīng)過(guò)電化學(xué)氧化方法在鉑金或硅表面形成的超薄晶體膜，還具有絕緣和對(duì)pH值敏感的特性[7]，從而有利于將來(lái)在微電子器件上應(yīng)用來(lái)滿足輸入或輸出信號(hào)的要求，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元與電子器件的通訊聯(lián)系，起到生物傳感器的作用。本研究的前期試驗(yàn)已經(jīng)利用微接觸印刷軟刻技術(shù)對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行了圖案化培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)帶正電荷的PEI大分子比LN等蛋白構(gòu)成的圖案更為完整穩(wěn)定[8,9]，但似乎仍存在神經(jīng)元突起延伸過(guò)短，生長(zhǎng)狀況尚不滿意的缺點(diǎn)?？梢栽O(shè)想，如果將LN和PEI混合作為一種界面材料，同時(shí)將微接觸印刷軟刻技術(shù)改為微流體印刷技術(shù)，應(yīng)該能增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞粘附并促進(jìn)突起生長(zhǎng)。為此，本實(shí)驗(yàn)擬采用微流體印刷技術(shù)對(duì)PLL、LN、PEI及PEI和LN的混合液四種不同底物進(jìn)行微加工，使紋狀體神經(jīng)元在底物上進(jìn)行圖案化培養(yǎng)；觀察、比較它們對(duì)神經(jīng)元粘附、突起生長(zhǎng)的影響，并觀察構(gòu)建神經(jīng)元流道圖案的效果。通過(guò)研究，希望能為將來(lái)在體外制作高效信號(hào)傳遞的功能化神經(jīng)芯片找到一種更佳的界面材料，為深入研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能和疾病發(fā)生機(jī)制提供更好的平臺(tái)。

材料與方法

材料

動(dòng)物：新生24 h內(nèi)的SD大鼠 (購(gòu)自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

主要試劑：培養(yǎng)基 (Neurobasal-A，Gibco)，B27添加劑 (Gibco)，L-谷氨酰胺(0.5 mmol/L)。軟刻中作為印章使用的聚二甲基硅氧烷 (PDMS，Sylgard 184，DownCorning，Midland，MI)；作為印刷“墨水”使用的大分子蛋白，包括層粘連蛋白laminin(LN：L2020-1MG，Sigma；使用濃度為20 mg/L)、多聚賴氨酸 (PLL， P4832，Sigma；分子質(zhì)量150～300 ku；使用濃度為0.05 mmol/L)和聚乙烯亞胺 (PEI，P3143，Sigma；分子質(zhì)量750 ku；使用濃度為0.01%)，以及PEI和LN的混合物 (使用濃度比為 PEI∶LN=1∶1)。所用抗體為 Anti-MAP2抗體 (Sigma，M1406)，Anti-GABA(r-aminobutyric acid) 抗體 (Sigma，N2052)。

圖案設(shè)計(jì)、主模版及PDMS印章的制備

主模版采用光刻方法制備，使用硅作為基片。首先使用L-Edit設(shè)計(jì)繪制圖案 〔流道圖案的參數(shù)規(guī)格根據(jù)神經(jīng)細(xì)胞胞體和突起的大小寬度，以及與松下公司8×8微電極陣列(multielectrode array)MEA-105、210型號(hào)的規(guī)格相匹配進(jìn)行設(shè)計(jì)〕(圖1A)，將設(shè)計(jì)好的圖案委托中國(guó)科學(xué)院微電子研究所加工，得到掩模鉻板后執(zhí)行光刻，曝光后得到含光刻膠圖案的主模版 (圖1B，C)。選用正性光刻膠作為微流體印刷模版的光刻膠，光刻膠圖案的浮凸深度依賴于光刻膠的涂覆厚度 (本試驗(yàn)在前課題組實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上[10]，將光刻膠的涂覆厚度加深至15 μm，以減小流道毛細(xì)阻力，利于液體流動(dòng))。按照說(shuō)明書(shū)[11]配置PDMS預(yù)聚體，澆注于主模版上，放入烘箱90℃下高溫固化2 h，經(jīng)“氧等離子”處理后保存在去離子水中。

圖1 圖案設(shè)計(jì)、主模版及PDMS印章制備 (A)采用L-Edit軟件設(shè)計(jì)的微流體的原始圖案 （流道圖案線寬：10 μm，線間距：50、100、150、200、300 μm）；(B)光鏡下微流體主模板圖案 （線間距：100 μm）；(C)微加工的熒光二抗，山羊抗兔-488的圖案Fig.1 Patterns design,template and PDMS stamp fabrication (A)Patterns of microfluidics printing template designed by L-Edit(lines width:10 μm;space between lines:50,100,150,200,300 μm).(B)Patterns'microscopic photographs of templates(space between lines:100 μm).(C)Immunofluorescent image of micropatterns with second antibody,goat-antirabbit 488

玻璃基片的表面修飾及印刷

印刷基片選用直徑0.8 cm、厚度0.17 mm的玻璃片。玻璃片用新鮮配置的熱Piranha溶液 〔即濃硫酸/雙氧水溶液 (H2SO4∶H2O2＝3∶1)〕處理以暴露表面帶負(fù)電荷的羥基集團(tuán)。之后，用去離子水清洗3次，每次5 min；然后用微流體印刷技術(shù)將PEI、LN、PLL及PEI+LN四種分子底物印刷在處理過(guò)的玻璃基片表面。采用Leica圖像分析系統(tǒng)對(duì)不同粘附底物表面的神經(jīng)元流道圖案單位面積 (mm2)內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量及突起長(zhǎng)度進(jìn)行分析。印刷過(guò)程如下：先切開(kāi)PDMS微流體印章的兩端，以便于加液及上下大氣貫通，促進(jìn)液體流注，修剪成型后，浸入75%乙醇中消毒20 min，超凈臺(tái)內(nèi)干燥，將印章倒扣于基片表面，施以一定的壓力，以便能與PDMS印章貼緊。將基片傾斜45°，從剪開(kāi)的上方經(jīng)注液口滴加微量液體，并用微量移液器反復(fù)輕輕吹吸，利用外加壓力使得液體流入微流道。把基片立于試管架上，進(jìn)一步利用重力使液體順利通過(guò)。靜置25～30 min，待液體干燥后，輕輕揭開(kāi)印章，即形成圖案。放置于24孔板孔內(nèi)，在光鏡下檢查玻璃基片圖案印刷質(zhì)量，種植細(xì)胞前用PBS清洗兩遍。如圖2所示。

圖2 微流體印刷 (A)微流體印刷示意圖；(B)PDMS印章修剪和使用Fig.2 The microfluidic printing (A)Schematic diagram of microfluidic printing;(B)Pruning and using of PDMS seal

細(xì)胞培養(yǎng)、免疫熒光化學(xué)染色及形態(tài)學(xué)觀察和測(cè)量

紋狀體神經(jīng)元取材于新生24 h內(nèi)的SD大鼠，冰凍麻醉20 min后，斷頭處死；低溫下無(wú)菌操作，取出腦部并剔除腦膜和血管，在解剖顯微鏡下分離出紋狀體；在37℃下用0.25%胰酶消化約15 min，后加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，離心 (1000 r/min)2～3 min，吸棄上清后加入培養(yǎng)基Neurabasal-A，輕輕吹打60次，用300目 (53 μm)過(guò)篩后再次離心(1000 r/min)4 min，棄上清液，重懸于Neurabasal-A培養(yǎng)基中。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并按不同細(xì)胞密度稀釋后接種，4～6 h后半量換液；之后，每3～4 d半量換液。培養(yǎng)7 d后取出玻璃基片，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.01 mol/L PBS漂洗2次，5 min/次；入0.1%PBST中打孔10 min；5%山羊血清封閉抗原，37℃下45 min，以抑制非特異性染色背景產(chǎn)生；吸棄血清，加一抗工作液〔應(yīng)用神經(jīng)元標(biāo)志物——微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein 2，MAP2)(1∶500)(小鼠來(lái)源)及抑制性中間神經(jīng)元標(biāo)志物——r-氨基丁酸(r-Aminobutyric acid，GABA)(1∶1000)(兔來(lái)源)免疫熒光雙標(biāo)染色以鑒別紋狀體神經(jīng)元〕，4℃過(guò)夜；0.01 mol/L PBS漂洗3次，5 min/次；入熒光標(biāo)記的二抗工作液 (594標(biāo)記的山羊抗小鼠熒光二抗和488標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗)(1∶500），37℃孵育1 h，避光；0.01 mol/L PBS漂洗3次，5 min/次；Hochest復(fù)染細(xì)胞核，37℃孵育10 min，避光；0.01 mol/L PBS漂洗2次，5 min/次。

利用Leica Qwin顯微鏡和圖像處理分析系統(tǒng)，觀察紋狀體神經(jīng)元在四種不同分子圖案表面的黏附、存活及突起生長(zhǎng)狀態(tài)及圖案形成情況。在20倍物鏡下隨機(jī)選取12個(gè)單位面積 (mm2)，計(jì)數(shù)每組單位面積中GABA陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量，并測(cè)量其突起的長(zhǎng)度，將突起長(zhǎng)度之和除以每組神經(jīng)元數(shù)，所得數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

結(jié) 果

不同黏附底物對(duì)圖案化培養(yǎng)紋狀體神經(jīng)元黏附、存活和突起生長(zhǎng)情況的影響

采用微流體印刷技術(shù)在玻璃表面微加工四種不同粘附材料：PEI、LN、PLL及PEI+LN的混合物，在流道間距均為150 μm規(guī)格下接種培養(yǎng)紋狀體神經(jīng)元，培養(yǎng)早期細(xì)胞形成圖案的趨勢(shì)不甚明顯，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)幾次換液、吹打，逐漸變得清晰，培養(yǎng)48 h后，可在PLL、PEI及PEI+LN組觀察到神經(jīng)元已經(jīng)基本循玻璃基片的圖案排列生長(zhǎng)，形成圖案。神經(jīng)細(xì)胞的胞體多黏附于流道線上，細(xì)胞已經(jīng)伸出細(xì)小的突起，突起沿圖案的流道生長(zhǎng)。在PLL組，神經(jīng)細(xì)胞多成團(tuán)分布在流道上。在LN組，神經(jīng)細(xì)胞多呈大片積聚狀態(tài)分布，未形成明顯的圖案。培養(yǎng)7 d時(shí)，可見(jiàn)PLL組圖案上細(xì)胞粘附力有所下降；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，有些細(xì)胞脫落使圖案的流道中斷，部分細(xì)胞偏離流道 (圖3A)。PEI組的流道圖案較為完整，細(xì)胞胞體變大但突起較短，細(xì)胞在注液口呈集落狀生長(zhǎng)，部分細(xì)胞之間能夠構(gòu)成聯(lián)系 (圖3B)。PEI+LN組細(xì)胞在注液口處分布均勻，神經(jīng)元似乎能更好地沿流道伸展，很少偏離流道；細(xì)胞胞體變大，突起延長(zhǎng)，與鄰近細(xì)胞之間構(gòu)成聯(lián)系 (圖3C)。在LN組，細(xì)胞聚集的現(xiàn)象明顯，而且隨著換液次數(shù)增多，出現(xiàn)細(xì)胞成片脫落現(xiàn)象，完全不能形成流道圖案 (圖3D)。通過(guò)免疫熒光化學(xué)染色方法鑒定可見(jiàn)，黏附在流道圖案上MAP2陽(yáng)性的成熟神經(jīng)元多為GABA陽(yáng)性的r-氨基丁酸能神經(jīng)元，這些神經(jīng)細(xì)胞胞體較圓，多為多極和雙極突起，很少見(jiàn)到單極突起。培養(yǎng)7 d后，對(duì)生長(zhǎng)在不同流道印刷材料表面的GABA陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量和突起長(zhǎng)度進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示：在PEI(169/mm2)、PLL(150/mm2)及PEI+LN(161/mm2)三組表面生長(zhǎng)的神經(jīng)元的數(shù)量明顯大于LN(80/mm2)組，而PEI+LN組 (40.64 μm)的神經(jīng)元突起長(zhǎng)度又大于 PEI組 (24.89 μm)和 PLL組(35.56 μm)，P＜0.05(圖 4)。

圖3 在PLL、PEI、PEI+LN及LN微流道圖案的帶負(fù)電荷的玻片上培養(yǎng)GABA抗體及MAP2抗體標(biāo)記7天后的紋狀體神經(jīng)元的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色圖案 (A)在PLL流道圖案上的紋狀體神經(jīng)元，流道間距為150 μm，Hochest染核×200；(B)在PEI流道圖案上的紋狀體神經(jīng)元，流道間距為150 μm，Hochest染核×200；(C)在LN+PEI流道圖案上的紋狀體神經(jīng)元，流道間距為150 μm，Hochest染核×200；(D)在LN流道圖案上的紋狀體神經(jīng)元，Hochest染核×200。箭頭表示流道內(nèi)液體流動(dòng)方向，bar=200 μmFig.3 Immunofluorescent image showing cultured striatal neurons for 7 days,labelled by antibodies of anti-GABA and anti-MAP2on PLL,PEI,PEI+LN and LN micropatterned flows on negatively charged glass coverslips (A)The striatal neurons on PLL micropatterned flows,the space between the flow lines was 150 μm,the nuclei of neurons were stained with Hochest×200;(B)The striatal neurons on PEI micropatterned flows,the space between the flow lines was 150 μm,the nuclei of neurons were stained with Hochest ×200;(C)The striatal neurons on PEI+LN micropatterned flows,the space between the flow lines was 150 μm,the nuclei of neurons were stained with Hochest×200;(D)The striatal neurons on LN micropatterned flows,the nuclei of neurons were stained with Hochest×200.Arrows indicating the direction of flow channel position,bar=200 μm

圖4 在LN、PEI、PLL及PEI+LN流道圖案上單位面積(mm2)內(nèi)培養(yǎng)7天后神經(jīng)元的數(shù)量及神經(jīng)元的平均突起長(zhǎng)度(μm)粘附效果的分析統(tǒng)計(jì)圖 n=12,P＜0.05Fig.4 The diagram showing adhesive effects tested by analysis of the number of neurons on the area(mm2)and average length of neuritis(μm)of neurons on LN,PEI,PLL and PEI+LN flow patterns respectively,after 7 day in the culture n=12,P＜0.05

紋狀體神經(jīng)元在不同規(guī)格PEI+LN流道圖案上培養(yǎng)的表現(xiàn)

依據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在確定PEI+LN能夠形成最清晰、完整的神經(jīng)元流道圖案的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察不同規(guī)格黏附底物流道圖案對(duì)細(xì)胞存活、生長(zhǎng)的影響，用PEI+LN黏附底物比較50 μm、100 μm、200 μm、300 μm四種不同線間距圖案細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果。發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)早期(24 h到3 d之內(nèi))，細(xì)胞在四種規(guī)格的流道圖案上分布并無(wú)明顯差異；隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，在50 μm最小規(guī)格的圖案上，神經(jīng)元多會(huì)越過(guò)流道生長(zhǎng)或聚集成團(tuán)進(jìn)而脫落，未能形成清晰的流道圖案。在間距200 μm的圖案上，神經(jīng)元分布較為分散，胞體大多位于圖案的流道上，基本未偏離；可見(jiàn)由神經(jīng)突起組成完整清晰的流道圖案。在100 μm間距的圖案上，上述兩種情況皆有出現(xiàn)。在300 μm間距的圖案上細(xì)胞散在分布，幾乎不按流道圖案生長(zhǎng)。各種情況如圖5所示。

圖5 在不同PEI+LN微流道圖案的帶負(fù)電荷的玻片上培養(yǎng)GABA抗體及MAP2抗體標(biāo)記7天后的紋狀體神經(jīng)元的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色圖案 線間距分別為50 μm(A)、100 μm(B),200 μm(C)及300 μm(D)，Hochest染核×400。箭頭表示流道內(nèi)液體流動(dòng)方向，bar=50 μmFig.5 Immunofluorescent image showing cultured striatal neurons for 7 days,labelled by antibodies of anti-GABA and anti-MAP2on different PEI+LN micropatterned flows on negatively charged glass coverslips Spaces between the flow lines are 50 μm(A),100 μm(B),200 μm(C)and 300 μm(D),the nuclei of neurons were stained with Hochest ×400.Arrows indicating the direction of flow channel position,bar=50 μm

討 論

本研究采用的微流體印刷技術(shù)是一種在基片表面進(jìn)行微細(xì)加工的新技術(shù)。它直接從印章與基片之間的凹槽注入“墨水”來(lái)加工圖案，不需要對(duì)修飾在表面的分子進(jìn)行干燥，這樣可以保持蛋白或酶類的穩(wěn)定性。另外，本微流體技術(shù)所需樣品只需數(shù)微升即可，故可用于珍貴樣本檢測(cè)[12,13]。借助在微流道中產(chǎn)生和維持不同溶液平行流動(dòng)的能力，微流體技術(shù)可固定細(xì)胞并模擬細(xì)胞周圍微環(huán)境，還可用于多通道的藥物檢測(cè)[14,15]。它可在微米甚至納米尺度 (30 nm～500 μm)基片上研究神經(jīng)細(xì)胞的形貌信息以及空間結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響[16,17]，因此微流體技術(shù)是研究材料細(xì)胞相互作用、制備神經(jīng)芯片的有效手段。

本研究在材料上培養(yǎng)的細(xì)胞是紋狀體神經(jīng)元，紋狀體是端腦基底神經(jīng)節(jié)中的重要結(jié)構(gòu)，主要由中等大小、樹(shù)突有大量棘刺的神經(jīng)元組成，幾乎所有皮質(zhì)都向紋狀體發(fā)出纖維，經(jīng)過(guò)整合后投射到丘腦和腦干等部位，參與神經(jīng)系統(tǒng)多種生理功能的調(diào)節(jié)。也是臨床上多種神經(jīng)元變性疾病的發(fā)病部位。本試驗(yàn)試圖用紋狀體神經(jīng)元建立神經(jīng)元流道圖案，使其能夠在材料上實(shí)現(xiàn)定位排列，這對(duì)于進(jìn)一步使其在體外與皮質(zhì)或黒質(zhì)神經(jīng)元共培養(yǎng)，并結(jié)合微電子設(shè)備形成人工環(huán)路來(lái)研究紋狀體神經(jīng)元的功能和相關(guān)疾病機(jī)制，無(wú)疑具有開(kāi)辟新路的重要意義。

本實(shí)驗(yàn)利用微流體技術(shù)加工了PEI、PLL、LN和PEI+LN四種界面材料，在相同培養(yǎng)密度下，觀察比較了神經(jīng)元在不同界面上構(gòu)建微流道圖案的情況。從最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，在無(wú)血清條件下，由于PLL會(huì)在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中與細(xì)胞培養(yǎng)基接觸而降解，故最終未能構(gòu)建成功完整的流道圖案。LN則可通過(guò)與整合素 (integrin)受體的結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的骨架蛋白和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而促進(jìn)細(xì)胞的黏附和成活[18]。此過(guò)程中，血清中的某些因子在一些環(huán)節(jié)上可能參與調(diào)節(jié)。所以，如用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)神經(jīng)元，可能會(huì)削弱LN通過(guò)血清促進(jìn)細(xì)胞黏附的作用；而且，培養(yǎng)中混于神經(jīng)元一起的血管內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞也會(huì)因失去血清支持而死亡，靠這些細(xì)胞支持的神經(jīng)元數(shù)量也會(huì)隨之減少，這些都可能是造成在單純LN上未能形成細(xì)胞圖案的原因。相比之下，PEI分子鏈上擁有大量的氨基基團(tuán)，是一種帶正電荷的多聚體。由于細(xì)胞表面帶有負(fù)電荷，細(xì)胞與材料之間的靜電吸附作用遂可加速細(xì)胞沉降在材料表面，形成相對(duì)牢靠的貼附。貼附以后，神經(jīng)元自身還會(huì)分泌一些細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，使其錨定得更加牢固[19,20]。因而，本研究中在PEI上粘附的細(xì)胞很多，但細(xì)胞突起較短 (與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似)，以致部分流道中斷，影響總體情況。而在PEI+LN材料上，除了顯示PEI對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有很強(qiáng)的吸附作用外，LN分子鏈上的IKVAV和 LQVQLSIR五肽序列能被細(xì)胞骨架蛋白integrin識(shí)別，影響突起上生長(zhǎng)錐的生長(zhǎng)速度和方向，所以能夠調(diào)控細(xì)胞遷移、突起生長(zhǎng)及突觸的形成和分化[21,22]。因此，本研究使用PEI+LN材料培養(yǎng)細(xì)胞能夠形成非常完整的神經(jīng)細(xì)胞流道圖案。在該材料上生長(zhǎng)的GABA陽(yáng)性表達(dá)纖維也較豐富，這些都是神經(jīng)細(xì)胞軸突和樹(shù)突發(fā)育的重要證據(jù)。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)還能見(jiàn)到，細(xì)胞圖案化培養(yǎng)的完整性不僅與黏附底物的特性密切相關(guān)，微結(jié)構(gòu)上的異質(zhì)性也會(huì)起一定作用，即并不是流道間距越寬，細(xì)胞圖案化生長(zhǎng)的效果就越明顯。這可能與PDMS軟印章微結(jié)構(gòu)的縱橫比例有關(guān)。曾有文獻(xiàn)指出，如果印章微結(jié)構(gòu)的線條間距/凹槽深度比超過(guò)20，PDMS會(huì)因在印章和基底材料上所施加壓力過(guò)大而塌陷，從而出現(xiàn)圖案失真的現(xiàn)象，這不利于細(xì)胞按流道圖案生長(zhǎng)[23]。相反，間距過(guò)小會(huì)使細(xì)胞容易聚集成團(tuán)而難以形成圖案化生長(zhǎng)。上述因素可能是神經(jīng)元在150 μm和200 μm流道間距規(guī)格的PEI+LN圖案上能夠清晰構(gòu)建流道圖案的原因。此外，PEI分子鏈上擁有大量的氨基氮原子使之具有很強(qiáng)的產(chǎn)生電子的特性，以至于它對(duì)金屬離子能產(chǎn)生很強(qiáng)的螯合作用[24]。因此，選用PEI+LN作為微流體印刷的材料，不僅能夠使細(xì)胞形成更為穩(wěn)定完整的圖案，而且更有利于將來(lái)實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元與電子器件的通訊聯(lián)系。

因此從本研究看，可以通過(guò)選擇合適的生物大分子混合物、通過(guò)一定規(guī)格的圖案設(shè)計(jì)兩方面因素，來(lái)人工調(diào)控神經(jīng)元在特定材料上的粘附和軸突生長(zhǎng)，以利于神經(jīng)芯片的制備?？梢哉f(shuō)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)神經(jīng)芯片的實(shí)現(xiàn)提供了極好的技術(shù)平臺(tái)，這對(duì)當(dāng)前神經(jīng)科學(xué)在我國(guó)的進(jìn)步應(yīng)有創(chuàng)新價(jià)值。

致謝 本課題得到中國(guó)科學(xué)院半導(dǎo)體所郭凱博士和清華大學(xué)材料工程系魏岳騰博士鼎力相助，在此一并致以誠(chéng)摯謝意。

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A Morphological Study on Creation of Neural Flow Patterns with Cultured Striatal Neuronsin VitroUsing A Microfluidic Technique

LUO Yali,GAO Kan,XU Qunyuan
Beijing Institute for Neuroscience,Beijing Center of Neural Regeneration and Repairing,Key Laboratory for Neurodegenerative Diseases of The Ministry of Education,Capital Medical University,Beijing 100069,China

This work was supported by grants from The"973"Program(2007CB947704)and The National Natural Science Foundation of China(81070977)

Oct 8,2010 Accepted:Dec 10,2010

XU Qunyuan,Tel:+86(10)83911464,E-mail:xuqy@ccmu.edu.cn

To make a designed neurochip practical,the adhesion and neurite growth of patterned striatal neurons were investigated by a microfluidic technique on the surface of mixture of polyethyleneimine(PEI)and laminin(LN)in vitro.Four different substrates,including LN,poly-L-lysine(PLL),PEI and mixture of PEI with LN(PEI+LN),characterized with strong positive surface charges were micropatterned on the silicon slide using a microfluidic technique.The striatal neurons from the forebrain of postnatal SD rats were culturedin vitroon these materials,respectively.The survival,adhesion and neurite growth of the cultured neurons,as well as their flow patterns on different substrates were evaluated,especially by immunofluorescent staining.Different effects of the neural flow patterns on different designs of the pattern(different spaces between the flow lines)fabricated on PEI+LN material were also compared using same method.The quantity of neuronal growth on the patterns of PEI,PLL and PEI+LN was apparently larger than that on LN.Moreover,the coated pattern of neurons on the PEI+LN was more integrated than on the others,and its morphology was more completely when the cells grew on the pattern with flow line spaces ranged between 150 and 200 μm.The substrate of PEI and LN mixture is in favor of creation of neural flow patterns，by using the microfluidic technology,when a suitable design of the pattern is selected.The observation in present study may help creation of some practical neurochips in the future times.

Microfluidic technique;Polyethyleneimine;Cell culture

2010-10-08；接受日期：2010-12-10

“973”計(jì)劃項(xiàng)目(2007CB947704)，國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81070977)

徐群淵，電話：(010)83911464，E-mail：xuqy@ccmu.edu.cn

R392.12，R319