Ad-siICOS-EGFP阻斷ICOS共刺激通路抑制角膜移植急性排異反應(yīng)

袁 偉，陸曉和，宮玉波，周 瑾

免疫排斥反應(yīng)是導(dǎo)致角膜移植尤其高危角膜移植失敗的主要原因。深入探討排斥反應(yīng)發(fā)生機(jī)理，通過(guò)多種手段及途徑抑制角膜移植免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生，仍是眼科領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)之一。近年來(lái)，利用基因治療技術(shù)將抑制免疫排斥反應(yīng)的基因轉(zhuǎn)入角膜防治移植免疫排斥反應(yīng)成為很有希望的新手段，其中，RNA干擾（RNAi）作為一種新興的基因阻斷技術(shù)，以其簡(jiǎn)單、有效、特異地下調(diào)細(xì)胞中基因的表達(dá)等優(yōu)勢(shì)，在人類基因功能研究、基因治療方面已顯示出巨大的前景[1-3]。

本研究利用RNA干擾及轉(zhuǎn)基因技術(shù)，采用球結(jié)膜下注射途徑，將攜帶有報(bào)告基因GFP的針對(duì)大鼠共刺激分子ICOS為目的基因的Ad-siICOSEGFP應(yīng)用至大鼠同種異體穿透性角膜移植模型，觀察Ad-siICOS-EGFP對(duì)大鼠植片存活時(shí)間的影響、抑制大鼠角膜移植急性免疫排斥反應(yīng)的效果，初步探索以ICOS為目的基因的RNAi技術(shù)用于防治角膜移植免疫排斥反應(yīng)的可行性及有效途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)Wistar大鼠30只為供體，SD大鼠60只為受體，雌雄不限，體質(zhì)量200～250 g，鼠齡2～3個(gè)月，南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào)：0033674）。動(dòng)物飼養(yǎng)溫度為 22～25℃，濕度為（50±5）%。

1.2 主要試劑 Ad-siICOS-EGFP（攜帶報(bào)告基因綠色熒光蛋白且表達(dá)ICOS-siRNA的重組腺病毒載體）溶液（北京本元正陽(yáng)基因有限公司提供），物理滴度：3.7×1011v.p./ml；Ad-EGFP（攜帶報(bào)告基因綠色熒光蛋白的重組腺病毒）溶液（北京本元正陽(yáng)基因有限公司提供）， 物理滴度：2.3×1011v.p./ml；30 g/L戊巴比妥鈉溶液（南方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。

1.3 方法

1.3.1 球結(jié)膜下注射 腹腔注射30 g/L戊巴比妥鈉溶液1.5 ml/kg麻醉，縫線開(kāi)右瞼，在手術(shù)顯微鏡下，選取角膜緣12點(diǎn)位、6點(diǎn)位處2個(gè)注射點(diǎn)，以微量進(jìn)樣器于近角膜緣球結(jié)膜下分別進(jìn)行注射溶液，注射時(shí)緩慢推注溶液，使其在球結(jié)膜下彌散。

1.3.2 動(dòng)物模型的建立及手術(shù)方法 以Wistar大鼠為供體，SD大鼠為受體，參照文獻(xiàn)[4]方法。術(shù)前20 min以0.5%托品酰胺滴眼液散瞳，腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液1.5 ml/kg麻醉。術(shù)前消毒，常規(guī)無(wú)菌操作，在手術(shù)顯微鏡下進(jìn)行。首先于供體角膜中央?yún)^(qū)鉆取直徑為3.5 mm植片，置于Healon中備用。在受體大鼠右眼行穿透性角膜移植術(shù)。做上下眼瞼牽引線，用直徑3.0 mm環(huán)鉆鉆取中央?yún)^(qū)角膜，將植片置于植床，以10-0尼龍絲線間斷縫合8針，線結(jié)暴露不包埋。手術(shù)做部分改進(jìn)，以粘彈劑Healon代替平衡鹽液，維持前房。術(shù)畢散瞳，結(jié)膜下注射慶大霉素2000 U，結(jié)膜囊涂四環(huán)素眼膏，縫合瞼緣。24 h后，拆除瞼緣縫線觀察角膜植片情況。角膜縫線在整個(gè)觀察期內(nèi)不拆除。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)注射途徑和注射溶液的種類不同進(jìn)行分組。所有受體大鼠隨機(jī)分為以下3組，每組20只鼠：A組為單純角膜移植對(duì)照組；B組為Ad-siICOS-EGFP注射組，術(shù)后即刻于每個(gè)球結(jié)膜注射點(diǎn)分別注射 Ad-siICOS-EGFP15 μl；C 組為Ad-EGFP注射組，術(shù)后即刻于每個(gè)球結(jié)膜注射點(diǎn)分別注射 Ad-EGFP15 μl。

1.4 術(shù)后裂隙燈觀察及評(píng)分 術(shù)后第1天開(kāi)始在裂隙燈顯微鏡下進(jìn)行臨床觀察，參照Larkin等[5]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，記錄每日排斥反應(yīng)指數(shù)（rejection index，RI），當(dāng)RI＞5或植片混濁一項(xiàng)達(dá)到 3時(shí)，即認(rèn)為排斥反應(yīng)發(fā)生。

1.5 術(shù)后取材及處理 各組大鼠分別于術(shù)后第5天隨機(jī)取10只大鼠，麻醉后取角膜，部分行RTPCR檢測(cè)；部分角膜冰凍切片行共聚焦顯微鏡觀察。各組其余大鼠進(jìn)行角膜植片存活時(shí)間統(tǒng)計(jì)。

1.6 共聚焦顯微鏡觀察GFP表達(dá)情況 摘取角膜后，冰凍切片機(jī)連續(xù)切片，厚度8 μm，激光共聚焦顯微鏡觀察熒光表達(dá)，以藍(lán)光激發(fā)GFP，觀察并攝片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理。統(tǒng)計(jì)方法：四組均數(shù)比較應(yīng)用單向方差分析（one-way ANOVA），樣本均數(shù)間的多重比較采用LSD法。

2 結(jié) 果

2.1 術(shù)后裂隙燈觀察及植片存活時(shí)間 60只SD大鼠接受同種異體穿透性角膜移植手術(shù)。其中52只大鼠角膜移植術(shù)后術(shù)眼前房形成良好，晶狀體透明，未見(jiàn)手術(shù)并發(fā)癥。8只被排除于觀察組外，其中5只為術(shù)中麻醉意外死亡，1只術(shù)后出現(xiàn)前房消失，2只出現(xiàn)并發(fā)性白內(nèi)障。均當(dāng)即補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。各組植片平均存活時(shí)間：A 組（9.800±0.632） d；B 組（14.700±1.418） d；C 組（10.000±1.054）d。 各組間角膜植片平均存活時(shí)間比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （F=52.383，P=0.000）。多重比較結(jié)果：B組與其余各組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P值均<0.05）；A組、C組組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。B組角膜植片平均存活時(shí)間最長(zhǎng)。

2.2 共聚焦顯微鏡觀察GFP表達(dá)情況 球結(jié)膜下注射Ad-siICOS-EGFP組 （B組）及球結(jié)膜下注射Ad-EGFP組（C組）角膜植片可見(jiàn)綠色熒光表達(dá)，表達(dá)位于角膜上皮層及整個(gè)角膜基質(zhì)層（圖1）。A組角膜植片未見(jiàn)綠色熒光表達(dá)。

圖1 GFP熒光蛋白在B、C組角膜上皮層及基質(zhì)層的表達(dá)（×400）

3 討 論

角膜移植的免疫排斥反應(yīng)主要是T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)性超敏反應(yīng)，隨著分子生物及免疫學(xué)的不斷發(fā)展，對(duì)其具體機(jī)制有了一定的認(rèn)識(shí)，但仍尚未完全闡明。T細(xì)胞的活化需要兩種不同的刺激信號(hào)[6]，第一信號(hào)由抗原呈遞細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）MHC-抗原肽復(fù)合物和T細(xì)胞上的TCR-CD3結(jié)合提供；第二信號(hào)即共刺激信號(hào)，由APC表面表達(dá)的共刺激分子與T細(xì)胞上的相應(yīng)受體作用產(chǎn)生。目前已知的共刺激分子有多種，主要是B7家族成員和CD28家族成員，可誘導(dǎo)共刺激分子（inducible costimulator，ICOS）是 CD28 家族的新成員，有實(shí)驗(yàn)表明，ICOS/ICOSL共刺激通路與大鼠角膜移植免疫排斥反應(yīng)有密切關(guān)系[7]。

RNA干擾 （RNAi）是一種新興的基因阻斷技術(shù)，具有能夠簡(jiǎn)單、有效、特異地下調(diào)細(xì)胞中基因的表達(dá)等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于多種疾病的研究中[8]。故本研究利用RNA干擾及轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將針對(duì)大鼠共刺激分子ICOS為目的基因的Ad-siICOS-EGFP采用球結(jié)膜下注射的方式轉(zhuǎn)染至大鼠同種異體穿透性角膜移植模型，觀察Ad-siICOS-EGFP對(duì)大鼠植片存活時(shí)間的影響，推斷阻斷ICOS共刺激通路抑制大鼠角膜移植急性免疫排斥反應(yīng)的效果，初步探索以ICOS為目的基因的RNAi技術(shù)用于防治角膜移植免疫排斥反應(yīng)的可行性及有效途徑。

本實(shí)驗(yàn)建立大鼠同種異體穿透性角膜移植模型，設(shè)立單純角膜移植組、球結(jié)膜下注射AdsiICOS-EGFP組、球結(jié)膜下注射Ad-EGFP組。研究發(fā)現(xiàn)：球結(jié)膜下注射Ad-siICOS-EGFP組角膜植片存活時(shí)間最長(zhǎng)，與其他各組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但植片仍不能長(zhǎng)期存活。

以上結(jié)果說(shuō)明，Ad-siICOS-EGFP可以通過(guò)阻斷ICOS共刺激通路，一定程度上抑制角膜移植急性免疫排斥反應(yīng)，保護(hù)角膜移植物。但研究也發(fā)現(xiàn)，球結(jié)膜下注射Ad-siICOS-EGFP組受體鼠移植角膜未能長(zhǎng)期存活，說(shuō)明角膜移植排斥反應(yīng)是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，共刺激途徑多樣化，單純阻斷ICOS一個(gè)共刺激通路雖然能夠較好的抑制急性排斥反應(yīng)的發(fā)生，延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間，但不足以誘導(dǎo)穩(wěn)定、持久的免疫耐受，植片未獲得長(zhǎng)期存活。更有效的抑制大鼠角膜移植免疫排斥反應(yīng)的方法仍有待進(jìn)一步研究。

[1]Annette Busch,Wayne A Marasco,Cornelia Doebis,et al.MHC class I manipulation on cellsurfaces by gentransfer of anti-MHC class I intrabodies-a tool for decreased immunogenicity of allogeneic tissue and cell transplants[J].Method,2004,34:240-249.

[2]Comer RM,King WJ,Ardjomand N,et al.Effect of administration of CTLA4-Ig as protein or cDNA on corneal allograft survival[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2002,43(6):1095-1103.

[3]Sato Y,Ajiki T,Inoue S.Gene silencing in rat-liver and limb grafts by rapid injection of small interference RNA[J].Transplantation,2005,27(79):240-243.

[4]Williams KA，Coster DJ.Penetrating corneal transplantation in the inbred rat:a new model.Invest Ophthalmol Vis Sci，1985，26(1)：23-30.

[5]Larkin DFP，Calder VL，Lightman SL.Identification and characterization of cells infiltrating the graft and aqueous humor in rat corneal allograft rejection[J].Clin Exp Immunol，1997，107(4)：381-391.

[6]Djukanovic R.The role of costimulation in airway inflammation[J].Clin Exp Allergy,2000,30(suppll):46-50.

[7]袁 偉，陸曉和，宮玉波，等.ICOS共刺激通路參與角膜移植免疫排斥反應(yīng)的研究[J]. 眼科研究，2009，（4）：27.

[8]Storz G.An expanding universe of noncoding RNAs[J].Science,2002,296(5571):1260-1263.