固定化β-葡萄苷酶轉(zhuǎn)化甜菊糖的研究

劉 虎，陳育如，2，*，姜中玉

(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京市微生物工程技術(shù)研究中心，江蘇省生物多樣性及生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省微生物與功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210046;2.南京師范大學(xué)泰州學(xué)院生物技術(shù)系、園藝系、制藥工程系，江蘇泰州225300)

固定化β-葡萄苷酶轉(zhuǎn)化甜菊糖的研究

劉 虎1，陳育如1，2，*，姜中玉1

(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京市微生物工程技術(shù)研究中心，江蘇省生物多樣性及生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省微生物與功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210046;2.南京師范大學(xué)泰州學(xué)院生物技術(shù)系、園藝系、制藥工程系，江蘇泰州225300)

用海藻酸鈉作為包埋材料，對巨大芽孢桿菌所產(chǎn)β－葡萄糖苷酶進(jìn)行了固定化，并對固定化酶轉(zhuǎn)化甜菊糖的條件進(jìn)行了研究。采用單因素分析方法探討了溫度、pH、時(shí)間、酶量、底物濃度和回收次數(shù)對轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果表明，固定化酶在40℃、pH7.0、酶量20g/100mL時(shí)轉(zhuǎn)化5d，可將1%甜菊糖(W/W)中的甜菊苷轉(zhuǎn)化96.45%，固定化酶經(jīng)4次重復(fù)利用后其轉(zhuǎn)化活力仍能維持在原活性的57.77%，具有較好的穩(wěn)定性和可回收性。該工藝操作簡單、成本較低，在轉(zhuǎn)化甜菊苷、提高萊鮑迪甙A純度方面具有潛在的應(yīng)用前景。

甜菊苷，固定化，生物轉(zhuǎn)化，β－葡萄糖苷酶，巨大芽孢桿菌

甜菊糖為甜葉菊(Stevia rebaudiana)中所含有的主要甜味成分，是一種天然甜味劑，因其高甜度、低熱值(約為蔗糖的1/300)、無毒副作用等特點(diǎn)，有望成為替代蔗糖的理想甜味劑［1］。甜菊糖主要成分是甜菊苷(stevioside，SS)和萊鮑迪甙A(rebaudioside A，RA)。RA甜味品質(zhì)最好，但含量較SS低，而SS有一定的后苦味［2］，因此人們希望純化RA使甜味更純正，但RA與SS在化學(xué)性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)和極性等方面都非常接近，因而通過化學(xué)方法純化比較困難［3］。在前期研究中，篩選的巨大芽孢桿菌具有高產(chǎn)β－葡萄糖苷酶能力，該酶可選擇性地將甜菊苷轉(zhuǎn)化，進(jìn)而使RA的純度得到提高［4］。但游離酶使用壽命低、可回收性差，限制了β－葡萄糖苷酶在甜菊苷轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。酶的固定化是用一定的材料將活性酶束縛或限制于一定的區(qū)域內(nèi)，但仍能進(jìn)行酶所特有的催化反應(yīng)，并可回收及重復(fù)使用的一種新技術(shù)。與游離酶相比，固定化酶具有產(chǎn)物分離簡單、可重復(fù)使用、操作連續(xù)及可控、工藝簡便等一系列優(yōu)點(diǎn)，近年來在食品、制藥、化學(xué)分析、環(huán)境保護(hù)等方面具有越來越廣泛的應(yīng)用［5］?，F(xiàn)已報(bào)道利用海藻酸鈉固定化β－葡萄糖苷酶［6－7］，巨大芽孢桿菌曾被應(yīng)用于一些結(jié)構(gòu)物質(zhì)的微生物轉(zhuǎn)化中，如轉(zhuǎn)化二氫異甜菊醇［8］，利用固定化的巨大芽孢桿菌對碳?xì)浠衔镞M(jìn)行羥基化［9］。本工作對選育的一株巨大芽孢桿菌(CCTCC NO:M209201)所產(chǎn)β－葡萄糖苷酶進(jìn)行了固定化，并用單因素分析方法對固定化酶轉(zhuǎn)化甜菊苷的特性進(jìn)行了研究，為RA純化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

圖1 甜菊糖苷分子的通用結(jié)構(gòu)式

巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium，CCTCC NO:M209201) 本實(shí)驗(yàn)室分離保存［4］;菌種保藏培養(yǎng)基

牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，瓊脂2%，pH7.2;發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基 玉米淀粉 4%，豆粕粉1%，硫酸鎂 0.04%，SS 0.2%，pH 7.0，搖瓶裝液量50mL/250mL;甜菊糖(甜菊苷SS>50%) 由甜菊糖公司提供。

CA－1390－1垂直層流潔凈工作臺(tái) 上海凈化設(shè)備有限公司;GNP－9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;HD－930型組合式全溫?fù)u床

江蘇太倉市博萊特實(shí)驗(yàn)儀器廠;ES－315高壓蒸汽滅菌鍋 TOMY，Japan;FA1004電子分析天平 上海天平儀器廠;HH－2數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華實(shí)驗(yàn)儀器廠;Agilent 1100高效液相色譜儀 Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng) 產(chǎn)酶培養(yǎng)基裝液量50mL/250mL三角瓶，接種活化培養(yǎng)24h的巨大芽孢桿菌液，接種量5%，37℃、220r/min培養(yǎng)36h。

1.2.2 水楊苷法測定酶活性

1.2.2.1 酶液的制備 發(fā)酵36h的培養(yǎng)液經(jīng)4000r/min離心10min得上清，即為酶液。

1.2.2.2 水楊苷溶液酶反應(yīng) 0.2mL水楊苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%，0.2mol/L、pH5.0醋酸緩沖液配制)溶液，加0.2mL粗酶液，混勻于50℃下溫育10min，取出立即加1mL 3，5－二硝基水楊酸(DNS)溶液，混勻后沸水浴5min，冷水冷卻后，蒸餾水定容至10mL，混勻，在540nm下測定其吸光度。

1.2.2.3 活力單位定義 1mL粗酶液在pH5.0、50℃下催化反應(yīng)1min產(chǎn)生1μg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)活力單位。

1.2.3 酶的固定化［10］參考文獻(xiàn)［10］方法，有所改動(dòng)。將1.4g海藻酸鈉與40mL β－葡萄糖苷酶溶液均勻混合(酶活力為779.68U/mL)，在37℃水浴中使海藻酸鈉溶化，并使海藻酸鈉溶液與酶溶液充分混勻。用5mL注射器吸取海藻酸鈉與酶的混合液，以10cm左右的高度逐滴注入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的氯化鈣溶液中，立即形成光滑的凝膠小球。濾出凝膠小球，更換氯化鈣溶液，在4℃冰箱中靜置硬化3h。再次濾出凝膠小球，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%NaCl洗滌后，用吸水紙吸干表面水分，貯存于4℃冰箱中備用。

1.2.4 固定化酶對甜菊糖的轉(zhuǎn)化 100mL 1%(W/W)甜菊糖轉(zhuǎn)化液中添加20g的固定化酶，40℃、200r/min動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化5d后，HPLC法檢測轉(zhuǎn)化液中甜菊糖SS的轉(zhuǎn)化情況。

1.2.5 甜菊糖含量的檢測 SS和RA含量HPLC法測定，色譜條件:Agilent 1100高效液相色譜儀，色譜柱為Kromasil－NH2(4.6mm×250mm)，210nm紫外檢測，流動(dòng)相為80%乙腈水溶液(V/V)，柱溫25℃，流速1.0mL/min，時(shí)間20min。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對甜菊糖SS轉(zhuǎn)化的影響

在100mL 1%(W/W)甜菊糖轉(zhuǎn)化液中，加5g固定化酶或相應(yīng)酶活力下的酶液，在不同的溫度下200r/min轉(zhuǎn)化5d，考察轉(zhuǎn)化溫度對甜菊糖轉(zhuǎn)化的影響。

由圖2可見，從25℃至35℃酶轉(zhuǎn)化率迅速增加，并使甜菊苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)到70.43%，從35℃至40℃轉(zhuǎn)化率變化不大，在40℃時(shí)達(dá)到最大值的75.65%，之后轉(zhuǎn)化率略有減少。

圖2 溫度對甜菊糖轉(zhuǎn)化的影響

2.2 pH對甜菊糖SS轉(zhuǎn)化的影響

在100mL 1%(W/W)甜菊糖轉(zhuǎn)化液中，調(diào)節(jié)初始pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，加10g固定化酶或相應(yīng)酶活力下的酶液，37℃、200r/min轉(zhuǎn)化5d，考察初始pH對甜菊糖轉(zhuǎn)化的影響。

由圖3可見，在固定化酶和游離酶兩種酶狀態(tài)下，SS轉(zhuǎn)化率都隨著pH的增大而增高，并在初始pH為7.0時(shí)，SS的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大，在固定化和游離狀態(tài)下分別達(dá)到86.47%和85.14%，而繼續(xù)增大pH時(shí)SS轉(zhuǎn)化率反而下降，不利于甜菊糖的轉(zhuǎn)化。不同的是在使用固定化酶轉(zhuǎn)化時(shí)，pH在6.0和8.0時(shí)其SS轉(zhuǎn)化率均在70%以上，高于游離酶，這表明固定化酶對pH的適應(yīng)性較大。

圖3 初始pH對甜菊糖轉(zhuǎn)化的影響

2.3 時(shí)間對甜菊糖SS轉(zhuǎn)化的影響

在100mL 1%(W/W)甜菊糖轉(zhuǎn)化液中加10g固定化酶，pH 7.0，30℃、220r/min轉(zhuǎn)化6d，考察轉(zhuǎn)化時(shí)間對固定化酶轉(zhuǎn)化的影響。

由圖4可見，在0至4d時(shí)，SS的轉(zhuǎn)化是持續(xù)的，轉(zhuǎn)化速率也相對穩(wěn)定，在第5d時(shí)轉(zhuǎn)化稍慢，但甜菊糖SS轉(zhuǎn)化率也達(dá)到91.92%，至第6d時(shí)轉(zhuǎn)化幾乎停滯，可見在前5d是甜菊糖轉(zhuǎn)化的主要階段。

表1 固定化酶回收次數(shù)對甜菊糖轉(zhuǎn)化的影響

圖4 時(shí)間對甜菊糖轉(zhuǎn)化的影響

2.4 底物濃度對甜菊糖SS轉(zhuǎn)化的影響

在100mL甜菊糖轉(zhuǎn)化液中加10g固定化酶，37℃、200r/min轉(zhuǎn)化3d，轉(zhuǎn)化液中甜菊糖濃度分別為0.1%、0.5%、1%、2%、3%(W/W)，考察底物濃度對固定化酶轉(zhuǎn)化的影響。

由圖5可見，在甜菊糖濃度在0.1%(W/W)時(shí)，甜菊苷的轉(zhuǎn)化率最大，但轉(zhuǎn)化量最小，而甜菊糖濃度為1%(W/W)時(shí)，經(jīng) 3d的轉(zhuǎn)化，SS減少量為4.41mg/mL，SS的轉(zhuǎn)化率達(dá)到75.8%，二者均較大。另外SS/RA也由2.43降為0.81，所以選擇底物濃度為1%(W/W)。

圖5 底物濃度對甜菊糖轉(zhuǎn)化的影響

2.5 酶量對甜菊糖SS轉(zhuǎn)化的影響

在100mL 1%(W/W)甜菊糖轉(zhuǎn)化液中添加固定化酶，使酶含量分別為1、5、10、20、30g/mL，35℃、150r/min轉(zhuǎn)化3d，檢測SS的轉(zhuǎn)化量及轉(zhuǎn)化率。

由圖6可見，酶添加量越大，SS轉(zhuǎn)化率也隨之增大，但當(dāng)酶量為 30g時(shí)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物甜菊雙糖甙(steviolbioside)的量減少，可能的原因是過多的酶使甜菊雙糖甙繼續(xù)轉(zhuǎn)化，減少了產(chǎn)物的積累量。故優(yōu)選酶添加量為20g/100mL，此時(shí)SS轉(zhuǎn)化率和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均較高。

1%(W/W)甜菊糖轉(zhuǎn)化原液和轉(zhuǎn)化2d的轉(zhuǎn)化液HPLC圖見圖7和圖8，圖8中SS被大量轉(zhuǎn)化而RA量基本保持不變，因此RA的純度得到相對提高。產(chǎn)物為甜菊雙糖甙可作為制備異甜菊醇和槐糖的原料，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

圖6 固定化酶量對甜菊糖轉(zhuǎn)化的影響

圖7 甜菊糖原液1%(W/W)的HPLC圖

圖8 甜菊糖1%(W/W)經(jīng)固定化酶轉(zhuǎn)化2d的HPLC圖

2.6 固定化酶的回收及再利用

一種固定化酶能否應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，關(guān)鍵在于固定化方法要簡單易行，固定化酶的活性要高，操作半衰期要長，固定化費(fèi)用要低。

回收:轉(zhuǎn)化液濾出固定化酶，0.9%氯化鈉溶液洗滌3次后，吸水紙吸干即可。

再利用:100mL 1%(W/W)甜菊糖轉(zhuǎn)化液加20g固定化酶，在最佳轉(zhuǎn)化條件下(40℃、200r/min)轉(zhuǎn)化5d，與初次利用固定化酶相比研究其轉(zhuǎn)化SS的性能。

由表1可見，經(jīng)4次的固定化酶的回收，SS轉(zhuǎn)化率由 96.45%降到 55.72%，而 RA相對含量由29.19%增加到 48.19%，相對酶活力降為原來的57.77%，表明固定化酶經(jīng)重復(fù)使用4次后仍保有較高的轉(zhuǎn)化活力，酶活力下降的原因可能為固定化材料在反復(fù)的攪拌下，其凝膠結(jié)構(gòu)發(fā)生改變致使酶產(chǎn)生泄漏造成的。

3 結(jié)論

本工作以海藻酸鈉為包埋材料，固定化巨大芽孢桿菌所產(chǎn)β－葡萄糖苷酶，研究了固定化酶對甜菊糖的轉(zhuǎn)化條件，通過單因素分析確定了最佳的轉(zhuǎn)化條件，即溫度為40℃、pH為7.0、酶量為20g/100mL、轉(zhuǎn)化時(shí)間為5d，該條件下可將1%甜菊糖(W/W)中SS轉(zhuǎn)化96.45%，固定化酶經(jīng)4次重復(fù)利用后其轉(zhuǎn)化活力仍能維持在原活性的57.77%，具有較好的穩(wěn)定性和可回收性，與游離酶相比，固定化的β－葡萄糖苷酶具有更為寬泛的溫度和pH適應(yīng)性。該工藝操作簡單、成本較低，在轉(zhuǎn)化甜菊苷、提高RA純度方面具有潛在的應(yīng)用前景。

［1］李曉瑜.甜菊糖苷的安全性研究進(jìn)展［J］.中國食品添加劑，2003(2):5－11.

［2］Starrat AN，Kirby CW，Pocs R，et al.Rebaudioside F，a diterpene glycoside from Stevia rebaudiana［J］.Phytochemistry，2002，59:367－370.

［3］Bondarev NL，Sukhanova MA，Reshetnyak OV，et al.Steviol glycoside content in different organs of Stevia rebaudiana and its dynamics during ontogeny［J］.Biologia Plantarum，2003，47(2):261－264.

［4］陳育如，劉虎，姜中玉.一種提高甜菊糖甜質(zhì)的方法［P］.中國專利:200910036066.5.2009－09－16.

［5］韓文靜.固定化酶的新型制備方法及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用［J］.食品工業(yè)科技，2009，30(2):345－347.

［6］陳慶慶，夏黎明.固定化β－葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化糖苷型異黃酮的研究［J］.高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào)，2007，21(2):304－309.

［7］王瑾，李默馨，李紅玲，等.殼聚糖/海藻酸鈉固定化β－葡萄糖苷酶的研究［J］.食品工業(yè)科技，2009，30(3):164－167.

［8］Yang LM，Hsu FL，Cheng JT，et al.Hydroxylation and glucosidation of ent－16 beta－h(huán)ydroxybeyeran－19－oic acid by Bacillus megaterium and Aspergillus niger［J］.Planta Medica，2004，70(4):359－363.

［9］Zhekova BY，Pishtiyski IG，Stanchev VS.Investigation on cyclodextrin production with cyclodextrin glucanotransferase from Bacillus megaterium［J］.Food Technology and Biotechnology，2008，46(3):328－334.

［10］趙林果，李麗娟，王平，等.海藻酸鈉固定化β－葡萄糖苷酶的研究［J］.生物加工過程，2007，5(4):25－31.

Study on transformation of stevioside by immobilized β－glucosidase

LIU Hu1，CHEN Yu－ru1，2，*，JIANG Zhong－yu1
(1.Nanjing Engineering and Technology Research Center for Microbiology，College of Life Science，Nanjing Normal University，Jiangsu Key Laboratory for Microbes and Functional Genomics，Nanjing 210046，China:2.Department of Biotechnology，Department of Horticulture，Department of Pharmaceutical Engineering，Taizhou College，Nanjing Normal University，Taizhou 225300，China)

Stevioside was hydrolyzed steviolbioside using immobilized β－glucosidase produced by Bacillus megaterium.The conditions of immobilized enzymes degrading stevioside were investigated.The embedding material was sodium alginate.The optimum method was determined by the single factor analysis.The results of conversion showed that 10mg/mL stevioside can be converted to steviolbioside by 96.45%for 5d under the condition of 40℃，pH7.0，20g/100mL immobilized β －glucosidase.The activity of immobilized enzyme recovered after 4 times was 57.77%of the original enzyme，which showed high stability and recyclability.The process was simple，low cost in the transformation of stevioside and had a potential application prospects for improvement of the purity of rebaudioside A.

stevioside;immobilization;biotransformation;β－Glucosidase;Bacillus megaterium

TS201.2

A

1002－0306(2011)04－0170－04

2010－03－03 *通訊聯(lián)系人

劉虎(1983－)，男，碩士研究生，主要從事應(yīng)用微生物的研究。

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)基金(200904055);江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目。