紅提葡萄致病菌的篩選及丁香抑菌成分提取工藝研究

解茂蕾，張子德，馬俊蓮，趙叢枝，王俠軼，張曉娜

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000)

紅提葡萄致病菌的篩選及丁香抑菌成分提取工藝研究

解茂蕾，張子德*，馬俊蓮，趙叢枝，王俠軼，張曉娜

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000)

以紅提葡萄為試材，對(duì)采后致病菌進(jìn)行了篩選和純化;以篩選出的紅提葡萄主要致病菌為目的菌，對(duì)丁香抑菌成分提取工藝進(jìn)行了研究。研究表明:篩選出的2號(hào)病菌可導(dǎo)致紅提葡萄黑點(diǎn)病，該菌屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科、復(fù)端孢屬;丁香抑菌成分的適宜提取條件為:乙醇濃度75%，料液比1∶15，提取時(shí)間45min，提取溫度40℃，在此條件下的抑菌圈直徑為1.957cm。

紅提葡萄，致病菌，丁香，抑菌成分，提取工藝

葡萄是主要水果之一，其皮薄、含水量高，易受病菌侵染從而導(dǎo)致在貯存或運(yùn)輸過(guò)程中腐爛、霉變。目前市場(chǎng)上普遍采用SO2來(lái)防止葡萄霉?fàn)€，效果較好，但在果肉組織中有亞硫酸鹽殘留，對(duì)人體健康有不良影響［1－2］。病原菌引起的腐爛病害是葡萄貯藏過(guò)程中的主要問(wèn)題。充分了解葡萄采后病原菌種類，有效控制葡萄采后病害，可為其保鮮技術(shù)提供理論基礎(chǔ)［3］?；瘜W(xué)防腐劑是果蔬采后普遍使用的防腐保鮮方法，但由于化學(xué)防腐劑危害健康、污染環(huán)境等缺陷;且用SO2保鮮貯藏保鮮過(guò)程中極易發(fā)生SO2傷害，嚴(yán)重影響果實(shí)的商品價(jià)值和食用價(jià)值［4］;因此天然防腐劑的研究和開(kāi)發(fā)利用日益顯示出其重要性和迫切性。很多研究已證實(shí)了中草藥的殺菌成分對(duì)果蔬貯藏保鮮的效果，其中丁香提取物的抑菌效果尤為顯著［5］。研制天然中草藥防腐保鮮劑是一個(gè)很有潛力的發(fā)展方向［6］。近年來(lái)，對(duì)葡萄采后病原菌的研究鮮有報(bào)道，特別是有關(guān)紅提葡萄的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文著重對(duì)紅提葡萄的采后病原菌種類及丁香提取物的抑菌效果進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅提葡萄 購(gòu)于保定市果品批發(fā)市場(chǎng);丁香購(gòu)于保定市老百姓大藥房。

KQ5200B型超聲波清洗器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 田間帶菌檢出 取外觀完好的果實(shí)各部位，用組織分離法在無(wú)菌條件下分離(PDA培養(yǎng)基)，檢查組織帶菌情況。

1.2.2 從采后染病組織中分離病原菌 葡萄在(0±1)℃條件下，從染病腐爛的葡萄果實(shí)中取樣。取樣方法:切取距離病斑2mm處的組織，表面滅菌后接種到PDA培養(yǎng)基上。25～28℃下培養(yǎng)3～5d，當(dāng)培養(yǎng)出的菌落直徑為1cm時(shí)，用接種針挑取菌落邊緣菌絲接入另一皿PDA培養(yǎng)基上，同樣于25～28℃培養(yǎng)。重復(fù)上述操作3次即可作為純化菌種回接果實(shí)，如發(fā)病癥狀與之前相同，便可作為采后病原菌轉(zhuǎn)接入試管，4℃冰箱保存，作為供試菌種進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定等研究。1.2.3 致病性鑒定

1.2.3.1 待返接果粒的準(zhǔn)備 選取健康無(wú)病果實(shí)，用清水洗凈后用70%乙醇溶液浸泡2min，再用無(wú)菌水沖洗干凈，放在超凈工作臺(tái)上晾干備用。每個(gè)菌株接種10個(gè)果粒，每果粒上接種1塊菌餅，分別設(shè)有傷和無(wú)傷兩種空白對(duì)照。

1.2.3.2 接種用病原菌的制備 取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5d的新鮮菌株，用打孔器取直徑約為5mm的菌體(含部分培養(yǎng)基，可較好地粘著在果實(shí)表面)接種。

1.2.3.3 返接實(shí)驗(yàn) 采用已純化菌株回接被測(cè)果粒，分“有傷”和“無(wú)傷”兩種接種方式，通過(guò)接種觀察病斑發(fā)展速度和發(fā)病程度，判斷被接菌株致病能力的大小。有傷接種:分別在每個(gè)果粒上用接種針刺破5個(gè)孔，孔眼可集中在一起使直徑約5mm，用打孔器取制備好的病原菌株，菌餅直徑約5mm，接種至傷口處，重復(fù)三次;無(wú)傷接種:同穗另取完好果粒直接接種，重復(fù)三次。兩種接種方式分別設(shè)空白對(duì)照。

1.2.4 病原菌鑒定［7－8］病原菌的鑒定主要以病害的癥狀、菌落形態(tài)及菌絲、孢子、分生孢子梗、分生孢子等特征，檢索文獻(xiàn)確定其屬和種。

1.2.5 丁香抑菌成分提取條件實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 乙醇濃度對(duì)丁香提取物抑菌作用的影響 丁香取5份，每份10g，加入70%、75%、80%、85%、90%的乙醇100mL，設(shè)定超聲波提取時(shí)間為15min、提取溫度55℃。

1.2.5.2 提取時(shí)間對(duì)丁香提取物抑菌作用的影響丁香取5份，每份10g，加入80%乙醇100mL，設(shè)定超聲波提取時(shí)間分別為30、40、50、60、70min，設(shè)定超聲波提取溫度為55℃。

1.2.5.3 提取溫度對(duì)丁香提取物抑菌作用的影響丁香取5份，每份10g，加入80%乙醇100mL，設(shè)定超聲波提取溫度分別為40、45、50、55、60℃，設(shè)定超聲波提取時(shí)間為15min。

1.2.5.4 不同料液比對(duì)丁香取物抑菌作用的影響每種藥材分別取5份，每份10g，設(shè)定乙醇濃度80%、超聲波提取時(shí)間15min、超聲波提取溫度55℃，料液比梯度為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30。

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用四因素三水平L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲提取條件，實(shí)驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。每一實(shí)驗(yàn)條件重復(fù)三次，共27組實(shí)驗(yàn)，抑菌圈直徑取3組平均值。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表L9(34)

2 結(jié)果與分析

2.1 紅提葡萄發(fā)病癥狀觀察

本實(shí)驗(yàn)共篩選出5種病菌，經(jīng)返接實(shí)驗(yàn)觀察，接種1、3、4、5號(hào)病菌的紅提葡萄發(fā)病慢，且只在有傷接種病菌的情況下發(fā)病;而接種2號(hào)病菌的紅提葡萄在接種后的第3d開(kāi)始發(fā)病，且有傷和無(wú)傷接種條件下均發(fā)病。因此確定2號(hào)病菌為主要致病菌。接種病菌2的葡萄病部顏色較深，菌斑周圍(葡萄病部中央)有一白點(diǎn)，邊界明顯，結(jié)合一些資料可以初步判定病菌2引起的是葡萄黑點(diǎn)病。

2.2 致病菌觀察及鑒定

病菌2在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)初期為白色后逐漸變成粉紅色，再培養(yǎng)1d后呈粉紅和白色相間的棉絮狀病菌。

在顯微鏡下觀察病菌2，可以看到病菌2的分生孢子梗無(wú)色、散生、不分枝，頂端束生分生孢子;分生孢子呈頭狀、卵圓形、大小不等;下端細(xì)胞具有一明顯的喙?fàn)钔黄稹Ｍㄟ^(guò)病菌檢索，可初步確定病菌2屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科、復(fù)端孢屬的病菌。

2.3 丁香抑菌成分提取工藝實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 乙醇濃度對(duì)丁香提取物抑菌效果的影響 圖1顯示了乙醇濃度對(duì)丁香抑菌圈直徑的影響。當(dāng)乙醇濃度在70%～90%之間變化時(shí)，丁香提取物的抑菌圈直徑呈先增加后下降的趨勢(shì)。丁香的最大抑菌圈直徑1.55cm出現(xiàn)在乙醇濃度為80%處。由此可見(jiàn)，乙醇濃度在80%時(shí)，丁香抑菌成分能被充分提取。所以將乙醇濃度75%、80%、85%設(shè)為正交實(shí)驗(yàn)的乙醇濃度水平。

圖1 不同乙醇濃度對(duì)丁香提取物抑菌效果的影響

2.3.2 提取時(shí)間對(duì)丁香提取物抑菌效果的影響 圖2顯示了不同處理時(shí)間對(duì)丁香抑菌圈直徑的影響。丁香的最大抑菌圈直徑1.437cm出現(xiàn)在提取時(shí)間為50min處。由此可見(jiàn)，并非超聲提取時(shí)間越長(zhǎng)抑菌率越高，在提取時(shí)間為50min時(shí)，抑菌率達(dá)到最大值，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，反而不利于中草藥提取物對(duì)致病菌的抑制作用。因此，將處理時(shí)間40、50、60min設(shè)為正交實(shí)驗(yàn)的處理時(shí)間水平。

2.3.3 提取溫度對(duì)丁香提取物抑菌效果的影響 圖3顯示了不同提取溫度對(duì)丁香抑菌圈直徑的影響。在實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的溫度范圍內(nèi)，抑菌圈直徑隨溫度的升高先增大，當(dāng)提取溫度在50℃時(shí)，丁香提取物的抑菌圈直徑達(dá)到最大值，而后一直呈下降趨勢(shì)，這表明藥材抑菌成分在高溫度下受到較大的破壞。丁香的最大抑菌圈直徑1.333cm出現(xiàn)在提取溫度50℃處。因此，將提取溫度45、50、55℃設(shè)為正交實(shí)驗(yàn)的提取溫度水平。

圖2 不同提取時(shí)間對(duì)丁香提取物抑菌效果的影響

圖3 不同提取溫度對(duì)丁香提取物抑菌效果的影響

2.3.4 料液比對(duì)丁香提取物抑菌效果的影響 圖4顯示了料液比對(duì)丁香提取物抑菌率的影響。在一定范圍內(nèi)，隨著料液比的增大丁香提取物的抑菌圈直徑明顯增大。在料液比為1∶20時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大值1.328cm，超過(guò)該比值抑菌圈直徑下降。因此，將正交實(shí)驗(yàn)料液比梯度設(shè)為1∶15、1∶20、1∶25。

圖4 不同料液比對(duì)丁香提取物抑菌效果的影響

2.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時(shí)間進(jìn)行了4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2和表3所示。

由表2的極差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)丁香抑菌圈直徑的影響次序?yàn)?乙醇濃度>時(shí)間>料液比>溫度。由表3的方差分析結(jié)果可知，乙醇濃度、料液比及提取時(shí)間對(duì)抑菌圈直徑影響極顯著，提取溫度對(duì)抑菌圈直徑影響為顯著;其中當(dāng)乙醇濃度為75%時(shí)抑菌效果與80%、85%兩個(gè)濃度水平相比差異顯著，當(dāng)時(shí)間為45、50min兩個(gè)水平時(shí)的抑菌效果與55min時(shí)相比差異極顯著，而在料液比和溫度兩個(gè)因素各水平之間對(duì)抑菌效果影響不顯著。從各個(gè)角度綜合分析，提取條件 A1C1B1D1，即乙醇濃度75%、提取時(shí)間45min、料液比1∶15、提取溫度40℃為丁香的適宜提取條件。

3 結(jié)論

據(jù)報(bào)道［9］，葡萄采后病原菌中青霉和黑曲霉在無(wú)傷接種時(shí)不能感染果實(shí)。本研究篩選出的致病菌在有傷和無(wú)傷接種時(shí)均感染果實(shí)，其可導(dǎo)致紅提葡萄黑點(diǎn)病，該菌屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科、復(fù)端孢屬。

本研究采用超聲波提取法提取丁香抑菌成分，通過(guò)對(duì)致病菌的抑菌實(shí)驗(yàn)，用抑菌圈直徑來(lái)評(píng)定提取效果。通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)確定丁香抑菌成分的適宜提取條件為:乙醇濃度75%，料液比1∶15，提取時(shí)間45min，提取溫度40℃。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

表3 方差分析結(jié)果

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Study on screening pathogenic bacterium from Red Globe Variety and the extraction technology of antimicrobial constituents from lilac flower

XIE Mao－lei，ZHANG Zi－de*，MA Jun－lian，ZHAO Cong－zhi，WANG Xia－yi，ZHANG Xiao－na
(College of Food and Technology，Agricultural University of Hebei，Baoding 071000，China)

Red Globe Variety as material，pathogenic bacterium were screened and purified then the selected main pathogenic bacterium of Red Globe Variety as the purpose bacterium，extraction process of antimicrobial constituents from lilac was studied.The results showed that No.2 strain pathogenic bacteria was identified as Deuteromycotina，Hyphomycetes，Moniliales，Moniliaceae，Cephalothecium and it caused black spot disease of Red Globe Variety.Appropriate extraction conditions were determined as follows:temperature 40℃，time 45min，75%ethanol solution as extracting solvent，the ratio of solid to liquid 1∶15(g/mL).At these conditions，the satisfactory antibacterial effect with the inhibition ring diameters was 1.957cm.

Red Globe Variety;pathogenic bacterium;lilac;antimicrobial constituents;extraction technology

TS201.1

A

1002－0306(2011)04－0152－03

2009－12－18 *通訊聯(lián)系人

解茂蕾(1983－)，女，在讀碩士研究生，研究方向:果蔬貯藏與加工。