直腸菌群對兩種抗性淀粉的體外發(fā)酵研究

龐秋芳，彭喜春，歐仕益，吳希陽

(暨南大學食品科學與工程系，廣東廣州510632)

直腸菌群對兩種抗性淀粉的體外發(fā)酵研究

龐秋芳，彭喜春*，歐仕益，吳希陽

(暨南大學食品科學與工程系，廣東廣州510632)

分別以兩種抗性淀粉為唯一碳源，對直腸菌群進行體外發(fā)酵。通過研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中兩種培養(yǎng)基的pH呈逐漸下降的趨勢;雙歧桿菌屬、乳桿菌屬的數(shù)量呈上升趨勢;腸球菌屬和腸桿菌屬的數(shù)量也能保持比較穩(wěn)定的數(shù)量，而擬桿菌的數(shù)量在發(fā)酵中后期開始減少，但總厭氧菌數(shù)比較穩(wěn)定，因此發(fā)酵過程中肯定有不同菌屬的生長演替;兩種碳源均能被腸道菌群利用產(chǎn)生短鏈脂肪酸，其中以丙酸的量最大。乳酸在發(fā)酵過程中被積累并能快速被一些直腸菌群利用而消耗。

抗性淀粉，體外發(fā)酵，腸道菌群，短鏈脂肪酸

結腸內存在一個非常復雜的微生態(tài)系統(tǒng)，含有400多種不同的細菌種類，而腸內菌群微生態(tài)的平衡穩(wěn)定對人體健康有著非常重要的作用。膳食纖維被認為對維持腸道菌群平衡起著重要的作用，而抗性淀粉是膳食纖維中的一種?？剐缘矸郏?］(resistant starch，RS)是指不能在健康人體小腸中消化吸收的淀粉及其降解物的總稱。RS作為一種新型的膳食纖維資源，其自身直接產(chǎn)生的作用較少，這些功效主要通過影響其他物質的吸收代謝，以及在結腸內發(fā)酵產(chǎn)生的次生產(chǎn)物而得到發(fā)揮。如RS能夠改變結腸微生物群落，促進腸道有益微生物繁殖，降低腸道pH、減少腐敗物和致癌物的產(chǎn)生、生成B族維生素、促進腸道蠕動、提高人體免疫力等［2］。由于RS可以“逃逸”小腸消化而到結腸內代謝，因此RS對腸道的健康意義，特別是在當今高脂、高蛋白的飲食模式下，顯得格外重要。本研究分別采用馬鈴薯抗性淀粉和紅薯抗性淀粉兩種可溶性膳食纖維作為唯一碳源，進行體外發(fā)酵，觀察在不同發(fā)酵時間段，RS與人體腸道各菌群生長數(shù)量及所產(chǎn)生短鏈脂肪酸之間的關系，以期發(fā)現(xiàn)RS在腸道中更為具體的作用，為以后進一步研究抗性淀粉的結腸發(fā)酵作用和健康作用機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

BBL培養(yǎng)基(雙歧桿菌選擇性培養(yǎng))、MRS培養(yǎng)基(乳桿菌選擇性培養(yǎng))、MAC培養(yǎng)基(腸桿菌選擇性培養(yǎng)、KEA培養(yǎng)基(腸球菌選擇性培養(yǎng)) 青島海博生物技術有限公司;血瓊脂平板 廣州環(huán)凱微生物科技有限公司;BDS培養(yǎng)基(擬桿菌選擇性培養(yǎng))

按以下配方配制(1L):牛肉粉5.0g，蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，Na2HPO44.0g，可溶性淀粉0.5g，葡萄糖 1.5g，L－半胱氨酸 0.2g，膽汁鹽 2.5g，亮綠0.0025g，瓊脂粉15g;不同培養(yǎng)基的具體用途如表1所示;發(fā)酵基礎培養(yǎng)基［4］、馬鈴薯抗性淀粉(potatoresistant starch，PRS)、紅薯抗性淀粉(sweet potato resistant starch，SPRS) 自制;乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、乳酸 色譜純，廣州市齊云生物技術有限公司。

表1 不同培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)目標

7.0 L厭氧罐 日本三菱;THZ－98A型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司;3524－2型CO2培養(yǎng)箱 SHELLAB公司;7890A型氣相色譜儀安捷倫。

1.2 實驗方法

1.2.1 富集培養(yǎng)基的制備 將上述配好的發(fā)酵基礎培養(yǎng)基(維生素類溶液除外)pH調為6.8，并分裝于總容量為55mL的具刻度離心管中，每管發(fā)酵基礎培養(yǎng)基量為46.5mL。分別稱取0.55g不同碳源(PRS、SPRS、葡萄糖)，加入到每46.5mL的發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中，滅菌。按配方［4］將相應維生素類溶液過濾除菌后，分別加入到已滅菌的含有不同碳源的培養(yǎng)基中，充分混勻，即得到總發(fā)酵液量為48mL的富集培養(yǎng)基。于4℃放置約12h，使底物(主要是使PRS和SPRS)充分水合。接種前將管置于 37℃ 水浴約30min。

1.2.2 樣品采集及準備 本研究的樣本來源于3個(2男1女)健康成人的糞便。要求:兩個月內未服用抗生素，且無腸道病史。采集每位實驗者的新鮮自然糞便50g置于密閉的無菌便盒中，備用。

將50g新鮮糞便用冷蛋白胨水(pH 7.3)500mL稀釋，即按1∶10的比例稀釋。加幾粒無菌玻璃珠渦旋15s使糞粒充分分散開來。稀釋的糞便液用4層無菌紗布過濾，并將過濾得到的糞便懸浮液密封于無菌器皿中。

1.2.3 直腸菌群的富集培養(yǎng) 將7mL糞便懸浮液加入到48mL發(fā)酵液中，即接種量為13%(發(fā)酵液中分別以PRS、SPRS及葡萄糖作為唯一碳源，另外以不加任何碳源的發(fā)酵液作為空白對照)，旋緊管蓋，并于37℃厭氧培養(yǎng)。

1.2.4 發(fā)酵液的分段收集及檢測 在0、4、8、12、24h分別測上述培養(yǎng)液的pH，并在相應的時間段取不同碳源的發(fā)酵液0.1mL，加入到裝有0.9mL PBS緩沖液(pH 7.4)的EP管中，混勻。然后，以一定的稀釋度將其分別接種于用于選擇性培養(yǎng)雙歧桿菌、乳桿菌、擬桿菌、腸球菌、腸桿菌和總厭氧菌的BBL、MRS、BDS、KEA、MAC和血瓊脂平板選擇性培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一定時間后細胞計數(shù)。平板接種后剩余發(fā)酵液分裝于各無菌管中，每15mL發(fā)酵液中加入0.5mL 20g/L CuSO4中止反應，并放于－20℃用于 SCFAs等的測定。

1.2.5 短鏈脂肪酸的測定［4］取上述存于－20℃的發(fā)酵液，待其解凍后，取2.0mL于一無菌管中，分別加入0.4mL 50%H2SO4和2.0mL乙醚，混勻，于定軌搖床振蕩混勻45min，再在室溫條件下3000r/min離心5min。取離心后的上清液于滅菌的EP管中，并加入已充分干燥的無水氯化鈣以去除殘留的水分，之后小心迅速地移取上清液于樣品管，用于GC測定。

短鏈脂肪酸的測定采用外標法，用乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸和乳酸作標準曲線。檢測器為氫火焰檢測器(FID);氣相色譜測定條件:載氣為N2，分流比為10∶1;流速2.0mL/min;用DB－FFAP色譜柱;升溫程序:120℃維持5min，以15℃/min升到250℃保持1min;燃燒爐溫度為280℃，待測樣品進樣量為2μL。

2 結果與討論

2.1 不同碳源發(fā)酵中pH的變化

由圖1可知，以PRS和SPRS為碳源的發(fā)酵液pH的變化趨勢大致相同，在發(fā)酵過程中pH不斷下降。其中，以PRS為碳源的發(fā)酵，其pH由0h的7.34發(fā)酵24h后降為4.74，以SPRS為碳源的發(fā)酵pH也由0h的7.33降到了24h的4.87。與陽性對照組葡萄糖比較，葡萄糖下降趨勢更快，并且發(fā)酵終pH由0h的8.55降為3.75。而無碳源的陰性對照組，pH下降趨勢較平緩，由0h的7.83降為24h的7.23。

圖1 不同碳源發(fā)酵過程中pH的變化

由上述結果可看出，葡萄糖是最先能被腸道菌群利用的碳源，PRS和SPRS則次之，但也能在結腸中發(fā)酵，從而導致不同的pH變化，其代謝產(chǎn)物并能較好地維持腸道酸性環(huán)境。

2.2 發(fā)酵中不同菌群的變化

2.2.1 雙歧桿菌群和乳桿菌的生長變化 由圖2和圖3可看出，在以PRS和SPRS為碳源發(fā)酵過程中，雙歧桿菌和乳桿菌的數(shù)量均有明顯增加;而以葡萄糖為碳源發(fā)酵4h后，雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量就開始明顯減少，可見葡萄糖對它們的生長促進作用不明顯?？傻贸?，PRS及SPRS作碳源對雙歧桿菌和乳桿菌的生長有益，并能促進它們增殖。

圖2 不同碳源發(fā)酵過程中雙歧桿菌生長情況

2.2.2 擬桿菌群、腸球菌及腸桿菌的生長變化 從圖4～圖6能很明顯地看出，添加葡萄糖的對照組擬桿菌、腸球菌及腸桿菌三種菌群均在發(fā)酵4、8、10h后數(shù)量開始急速下降;而以PRS和SPRS為碳源的12h后三種菌群的數(shù)量才開始緩慢減少。其原因可能是葡萄糖在8h前被快速利用，發(fā)酵8h后產(chǎn)生大量SCFAs，pH迅速降為4.03(由圖1可知)，從而抑制了這三種菌群的生長，當然也有可能是由于碳源的缺乏導致。PRS和SPRS為碳源時，pH在8h前快速下降，10h后下降趨勢減緩，由于酸性的積累，致使擬桿菌、腸球菌及腸桿菌三種菌群10h后緩慢減少。但總體來看，PRS和SPRS為碳源發(fā)酵時，相對于我們前面對不溶性膳食纖維的研究而言(另文發(fā)表)，擬桿菌生長在24h后的數(shù)量稍有減少，而腸球菌及腸桿菌的數(shù)量變化并不顯著;無糖對照組菌量的顯著變化的主要原因可能是由于碳源的缺乏導致。

圖3 不同碳源發(fā)酵過程中乳桿菌生長情況

圖4 不同碳源發(fā)酵過程中擬桿菌生長情況

圖5 不同碳源發(fā)酵過程中腸球菌生長情況

圖6 不同碳源發(fā)酵過程中腸桿菌的生長情況

2.2.3 總厭氧菌群生長變化 由圖7可看出，以PRS和SPRS為碳源的兩組，其數(shù)量級由0h的7.7分別升到發(fā)酵24h后的8.67和8.40，略微有所增加，但總體來說，在整個發(fā)酵過程中總厭氧菌保持著相對穩(wěn)定的狀態(tài)，原因可能是腸道中各菌群對營養(yǎng)成分的競爭作用，從而導致各菌群的此消彼長，最終維持總菌群數(shù)的平衡［5］。而對照組的葡萄糖與無碳源組總厭氧菌數(shù)量8h后迅速減少。

圖7 不同碳源發(fā)酵過程中總厭氧菌的生長情況

2.3 發(fā)酵中短鏈脂肪酸的變化

2.3.1 短鏈脂肪酸在發(fā)酵中的變化 由圖8～圖9可看出，以PRS為底物發(fā)酵時，其產(chǎn)生的乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸變化趨勢大致相同;以SPRS為底物發(fā)酵，其產(chǎn)生的四種短鏈脂肪酸(除乳酸)變化也趨于一致，并且兩種底物都隨著發(fā)酵時間的持續(xù)，短鏈脂肪酸(SCFA)的量總體呈上升趨勢，從而使腸道pH下降，由此與發(fā)酵中pH變化(圖1)趨勢相吻合。比較圖8、圖9可發(fā)現(xiàn)，不論是以PRS還是以SPRS作發(fā)酵底物，發(fā)酵產(chǎn)生的丙酸量最多，丁酸最少。以PRS和SPRS為底物發(fā)酵時，4～8h乳酸量達到最大，之后開始下降，與圖2、圖3雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量相對應。原因可能是部分直腸菌群(如雙歧桿菌和乳桿菌等)利用PRS、SPRS產(chǎn)生的乳酸可能起到中間產(chǎn)物的作用，為其它腸道菌群的生長提供能量，如硫酸鹽還原菌［5］，并隨著其它菌群的大量繁殖而減少。

圖8 馬鈴薯抗性淀粉發(fā)酵過程中SCFAs的變化

圖9 紅薯抗性淀粉發(fā)酵過程中SCFAs的變化

3 結論

人體結腸內存在大量的相互制約、平衡生長的微生物，其中常見的有益菌群為乳酸菌和雙歧桿菌，通過其菌體本身、分泌物和代謝產(chǎn)物對腸道健康起著重要的作用，如:抵抗致病菌的侵襲、增強腸道免疫力、營養(yǎng)結腸、預防結腸癌等;其它腸道常駐菌有腸桿菌、腸球菌、擬桿菌等，它們一般為條件致病菌。許多因素可影響腸道內的微生物，如宿主的年齡、易感性、營養(yǎng)需求、免疫狀況、腸道pH、胃腸轉運時間、菌群之間的相互作用以及腸內可酵解底物的量和種類。在這些因素中，細菌生長所需底物的量和類型是最具有影響的因素［6］。本研究首次將抗性淀粉、短鏈脂肪酸以及直腸菌群三者的相互關系聯(lián)系起來，而不僅是研究抗性淀粉與短鏈脂肪酸之間的關系。從本實驗的結果可以看出，不同直腸菌群在兩種RS為碳源發(fā)酵時，腸球菌、腸桿菌數(shù)量變化不大，而擬桿菌數(shù)量減少，雙歧桿菌及乳桿菌數(shù)量顯著增加，但總厭氧菌等的數(shù)量都能維持比較穩(wěn)定的水平，說明RS發(fā)酵過程中，肯定有不同菌屬生長的演替，同時也說明RS在一定程度上能維持腸道菌群的平衡。有研究報道顯示，適量給予RS可以較好地改善腸道動力，增加腸道容積，促進腸道有益菌的定植［7］，本實驗也證實了RS具有益生的功效(可促進有益菌如雙歧桿菌、乳桿菌的增殖)，這與現(xiàn)有的一些文獻報道結果是一致的［2－3，6］;由SCFAs的產(chǎn)生引起的pH顯著降低并未導致總厭氧菌的數(shù)量快速下降，因此可能并不是抑制腸道菌群中致病菌生長的主要原因，這與現(xiàn)有的報道也不盡相同［8］，但是它與我們前期對不溶性膳食纖維的研究結果一致(另文發(fā)表)。

RS在大腸中被結腸微生物(厭氧菌)發(fā)酵或部分發(fā)酵后，產(chǎn)生揮發(fā)性SCFAs，降低腸道及糞便pH，在主要的3種SCFAs中，以丁酸對結腸細胞的營養(yǎng)作用最強，對人體結腸健康方面起著尤為重要的作用［9－11］。SCFAs的種類和數(shù)量和pH、微生物菌群及發(fā)酵底物有很大關系［12］。本實驗證明，RS都能被不同的直腸菌群利用并產(chǎn)生SCFAs，而且該兩種RS被直腸菌群發(fā)酵利用時，丙酸的產(chǎn)量明顯大于乙酸，這與早期的許多文獻［2，13－14］的報道認為乙酸產(chǎn)量最大的結果不一致，至于丙酸的產(chǎn)生與腸道菌群的特殊相關性有待于進一步的研究;乳酸可能是直腸菌群發(fā)酵利用RS產(chǎn)生的中間代謝物，能為腸道其它菌群提供能源，這與文獻報道的結果是一致的［5，13，15］。在我們的研究中，丁酸的產(chǎn)量較低，也并沒有如其它文獻報道的比其它膳食纖維發(fā)酵所產(chǎn)生的更多［16－17］。

［1］尚曉婭，高群玉，楊連生.抗性淀粉對糖脂以及腸道代謝影響的研究進展［J］.食品工業(yè)科技，2005，26(4):179－180.

［2］王瑤，鄔應龍，岳雙明.抗性淀粉對動物腸道代謝的影響［J］.飼料工業(yè)，2007，28(24):49－50.

［3］Bourquin LD，Titgenmeyer EC，F(xiàn)ahey GC.Fermentation of various dietary fiber sources by human fecal bacteria［J］.Nutr Res，1996，16(7):1119－1131.

［4］Schneider SM，F(xiàn)ernand GP，Rodolphe A，et al.Effects of total enteral nutrition supplemented with a multi－fibre mix on faecal short－chain fatty acids and microbiota［J］.Clin Nutr，2006，25:82－90.

［5］Vernazza CL，Gibson GR，Rastall RA.In vitro fermentation of chitosan derivatives by mixed cultures of human faecal bacteria［J］.Carbohydr Polym，2005，60:539－545.

［6］何梅，洪潔，楊月欣.抗性淀粉對大鼠腸道菌群的影響［J］.衛(wèi)生研究，2005，34(1):87.

［7］Le Blay GM，Michel CD，Blottiere HM，et al.Raw potato starch and short—chain fructo—oligosaccharides affect the composition and metabolic activity of rat intesfinal microbiota differently depending on the caecocolonic segment involved［J］.J Appl Microbiol，2003，94:312－320.

［8］郭興華.益生菌基礎與應用［M］.北京:北京科學技術出版社，2002:28－30.

［9］Young GP，Le Leu RK.Resistant starch and colorectal neoplasia［J］.J AOAC Int，2004，87(3):775－786.

［10］Baue MM，F(xiàn)lorian S，Muller SK，et al.Dietary resistant starch type 3 prevents tumor induction by 1，2－dimethylhydrazine and alters proliferation，apoptosis and dedifferentiation in rat colon［J］.Carcinog，2006，27(9):1849－1859.

［11］Le Leu RK，Brown IL，Hu Y，et al.Suppression of azoxymethane－induced colon cancer development in rats by dietary resistant starch［J］.Cancer Biol＆ Ther，2007，6(10):1621－1626.

［12］王婭芳，孫曉紅.不同膳食成分對人體胃腸道短鏈脂肪酸的影響［J］.預防醫(yī)學情報雜志，2005，21(4):425.

［13］陳燕，曹郁生，劉曉華.短鏈脂肪酸與腸道菌群［J］.江西科學，2006，24(1):38－41.

［14］Miquel N，Ph D，Daniel MP，et al.Long－term intake of resistant starch improves colonic mucosal integrity and reduces gut apoptosis and blood immune cells［J］.Nutr，2007，23:861－870.

［15］于卓騰，杭蘇琴，姚文，等.腸道產(chǎn)丁酸細菌及其丁酸產(chǎn)生機制的研究進展［J］.世界華人消化雜志，2006，25(14):2533.

［16］Liu Ruiping，Xu Guifa.Effects of resistant starch on colonic preneoplastic aberrant crypt foci in rats［J］.Food Chem Toxicol，2008，46:2672.

［17］姚蕊，張守文.抗性淀粉的研究發(fā)展現(xiàn)狀與前景［J］.糧食與食品工業(yè)，2006，13(1):31.

Study on fermentation of two resistant starch by colon microflora in vitro

PANG Qiu－fang，PENG Xi－chun*，OU Shi－yi，WU Xi－yang
(Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China)

Potato resistant starch and sweet potato resistant starch were taken respectively as only carbon source to ferment colonic microflora in vitro.The results showed that during the fermentation process in vitro，the pH value of the two culture was gradually decline.In two media with different carbon source，the colonies counts of Bifidobacterium，Lactobacillus showed an upward trend，the number of Enterococcus and Enterobacter remained relatively stable at different fermentation periods，the number of Bacteroides began to reduce in the late of fermentation，and the number of total anaerobic bacterium remained stable.Therefore，the growth succession of different species must be sure in the process of fermentation.The colon microbial could utilize the two carbon sources to produce SCFAs，of which the largest amount was propionate.During the fermentation process lactic acid was accumulated and promptly consumed by colonic microflora.

resistant starch;fermentation in vitro;colonic microflora;short chain fatty acids

TS201.3

A

1002－0306(2011)04－0148－04

2009－12－21 *通訊聯(lián)系人

龐秋芳(1982－)，女，碩士生，研究方向:食品安全。

暨南大學青年基金(51208029)。