無(wú)花果高活性內(nèi)生真蓖菌株的篩選

張弘弛，馬養(yǎng)民，劉 瑞

(1.山西大同大學(xué)農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山西大同037009;2.陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西西安710021)

無(wú)花果高活性內(nèi)生真蓖菌株的篩選

張弘弛1，馬養(yǎng)民2，*，劉 瑞1

(1.山西大同大學(xué)農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山西大同037009;2.陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西西安710021)

從無(wú)花果(Ficus carice)的根、莖、葉中分離出64株內(nèi)生真菌，以金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、白假絲酵母菌(Saccharomyces albicans)、粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)和青霉菌(Penicillium sp.)為指示菌種，對(duì)這些內(nèi)生真菌進(jìn)行抗菌活性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，高活性菌株隸屬于鏈格孢屬(Alternaria sp.)、瓶梗青霉屬(Paecilomyces sp.)、青霉屬(Penicillium sp.)和鐮孢霉屬(Fusrium sp.)等屬。綜合分析認(rèn)為，編號(hào)為FL28內(nèi)生真菌的抑菌作用值得進(jìn)一步研究。

無(wú)花果，內(nèi)生真菌，生物活性，分類鑒定

無(wú)花果(Ficus carice)是?？坡淙~小喬木或灌木，成熟或近成熟的花序托內(nèi)藏花和瘦果，故名無(wú)花果。無(wú)花果營(yíng)養(yǎng)豐富，含有豐富的有機(jī)酸、氨基酸、糖類、維生素、果膠以及無(wú)花果元酶、微量元素等［1－2］。還有提高人體免疫力、延緩衰老和抑制多種癌細(xì)胞發(fā)生或發(fā)展的特殊功效。目前已經(jīng)從無(wú)花果中分離出13種抗癌活性成分，對(duì)治療多種癌癥有明顯效果［2］。健康藥用植物中蘊(yùn)含著大量的內(nèi)生真菌，這些內(nèi)生真菌與宿主之間具有緊密的生態(tài)關(guān)系，產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物在病蟲害的生物防治、醫(yī)藥工業(yè)上的用途和范圍逐漸增大，成為尋找新的天然活性產(chǎn)物的重要方向，因此，內(nèi)生真菌的研究引起人們的廣泛關(guān)注，成為目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一［3－7］。本文就無(wú)花果內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的抗菌活性進(jìn)行研究，旨在尋找更多的高活性菌株，為進(jìn)一步開發(fā)利用內(nèi)生真菌資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

植物材料及來(lái)源 從無(wú)花果(Ficus carice)的根、莖、葉中分離出64株內(nèi)生真菌［8］;指示菌株及來(lái)源

革蘭氏陽(yáng)性菌:金色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus);革蘭氏陰性菌:大腸桿菌(Escherichia coli);動(dòng)物病原菌:白假絲酵母菌(Saccharomyces albicans);植物病原菌:粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)和青霉菌(Penicillium sp.)，以上菌種由西北農(nóng)林科技大學(xué)資環(huán)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供;培養(yǎng)基 發(fā)酵用培養(yǎng)基為PDA液體培養(yǎng)基;金黃色葡萄球菌和大腸桿菌培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基;病原菌用PDA固體培養(yǎng)基，滅菌條件為121℃、30min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的培養(yǎng)及發(fā)酵產(chǎn)物的提取 將保藏的無(wú)花果內(nèi)生真菌［8］無(wú)菌接種于制備好的PDA培養(yǎng)平板上，28℃，培養(yǎng)3d后，無(wú)菌操作從培養(yǎng)平板取0.6cm的內(nèi)生真菌菌餅，接種至含400mL查氏液體培養(yǎng)基1000mL錐形瓶中，28℃，130r/min搖床上振蕩培養(yǎng)12～15d后，從搖床中取出培養(yǎng)物，4層紗布過(guò)濾得菌絲和發(fā)酵濾液，得到發(fā)酵液和菌絲體。發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯萃取液減壓濃縮后得到粗品代謝物，備用。菌絲于45℃烘干，研磨成粉，稱取各菌株菌絲0.1g，用丙酮超聲萃取3次，萃取液減壓濃縮后得到粗品代謝物，備用。

1.2.2 抑菌活性測(cè)試

1.2.2.1 測(cè)試培養(yǎng)基的制作 測(cè)試菌用5mL無(wú)菌生理鹽水直接沖洗受試菌的斜面，搖勻后，滴一滴于血球計(jì)數(shù)器載玻片小室內(nèi)，蓋上蓋玻片(注意排除氣泡)，顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。然后稀釋到濃度為106個(gè)/mL的菌懸液。將1mL菌懸液快速倒入40～50℃融化的9mL培養(yǎng)基中，搖勻后迅速裝到培養(yǎng)皿中，冷卻后得到含有不同測(cè)試菌的培養(yǎng)基。

1.2.2.2 代謝產(chǎn)物抗菌活性篩選(濾紙片法)［9］將1.2.1中所得粗品代謝物分別配成10mg/mL的丙酮溶液。然后取濾紙片(Φ=0.6cm，已滅菌)浸沒(méi)于粗品丙酮溶液中，使其充分飽和，略微風(fēng)干后，接于含有測(cè)試菌的培養(yǎng)皿中，各內(nèi)生真菌的粗品代謝物對(duì)測(cè)試菌分別作3個(gè)重復(fù)，以丙酮作為CK。將制好后的培養(yǎng)皿在28℃恒溫培養(yǎng)2～4d后觀察，測(cè)其抑菌圈的大小。

1.2.3 內(nèi)生真菌的鑒定 采用插片培養(yǎng)方法，對(duì)有拮抗作用的無(wú)花果內(nèi)生真菌進(jìn)行分類鑒定，分類檢索參照文獻(xiàn)［10－11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)花果內(nèi)生真菌發(fā)酵液提取物對(duì)5種測(cè)試菌的抑菌效果

通過(guò)對(duì)64株無(wú)花果內(nèi)生真菌發(fā)酵液提取物的抑菌實(shí)驗(yàn)(表1)，發(fā)現(xiàn)28株內(nèi)生真菌發(fā)酵液提取物對(duì)至少3種以上的測(cè)試菌具有抑制作用，約占總數(shù)的43.8%;21株對(duì)4種以上的測(cè)試菌具有抑制作用，約占總數(shù)的32.8%;9株對(duì)5種測(cè)試菌具有不同程度的抑制作用，活性菌株占內(nèi)生真菌總數(shù)的14.1%，且重復(fù)實(shí)驗(yàn)較穩(wěn)定。從分離部位看，根15株、莖7株、葉21株，其比例分別為23.4%、10.9%、32.8%。從抑制指示菌種類看，無(wú)花果內(nèi)生真菌發(fā)酵液提取物對(duì)革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)有抗性的菌株最多，有36株(占總菌株數(shù)的56.3%)，且有21株為高活性菌株(抑菌圈直徑Φ≥16mm);其次是對(duì)青霉有抗性的菌株為29株(占總菌株數(shù)的45.3%)，9株為高活性菌株;對(duì)金黃色葡萄球菌為 28株(占總菌株數(shù)的43.7%)，24株為高活性菌株;對(duì)白假絲酵母為25株(占總菌株數(shù)的39.1%)，8株為高活性菌株;抑制粘紅酵母的菌株最少為14株(占總菌株數(shù)的21.9%)，但全部是高活性菌株。

9株對(duì)所有測(cè)試菌都有抑菌效果的無(wú)花果內(nèi)生真菌編號(hào)分別為 FL10、FL11、FL16、FL28、FR01、FR11、FR12、FR13和FR14，其發(fā)酵液提取物具有很強(qiáng)的抑菌性。發(fā)酵液提取物抑菌活性強(qiáng)的內(nèi)生真菌主要分布在青霉屬、鐮孢霉屬、鏈格孢屬、瓶梗青霉屬和葡萄孢屬。

2.2 無(wú)花果內(nèi)生真菌菌絲丙酮提取物對(duì)5種測(cè)試菌的抑制作用

由表2可知，在64株無(wú)花果內(nèi)生真菌中，有13株菌株的菌絲丙酮提取物對(duì)至少3種以上的測(cè)試菌具有抑制作用，約占總數(shù)的20.3%;9株對(duì)5種測(cè)試菌具有不同程度的抑制作用，活性菌株占內(nèi)生真菌總數(shù)的14.1%，且重復(fù)實(shí)驗(yàn)較穩(wěn)定。對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白假絲酵母、粘紅酵母和青霉有抑制作用的分別有36株、41株、9株、14株、13株，分別約占總數(shù)的56.3%、64.1%、14.1%、21.9%、20.3%。由此可見，所分離得到的64株無(wú)花果內(nèi)生真菌中，其菌絲丙酮提取物對(duì)細(xì)菌抑制作用較強(qiáng)，而對(duì)酵母菌和青霉抑制作用弱。

9株對(duì)所有測(cè)試菌都有抑菌效果的無(wú)花果內(nèi)生真菌編號(hào)分別FL7、FL19、FL22、FL23、FL24、FL25、FL28、FS12和FR2，這些菌株的菌絲丙酮提取物對(duì)5種測(cè)試菌均有較強(qiáng)的抑制作用。菌絲丙酮提取物抑菌活性強(qiáng)的內(nèi)生真菌主要分布在鏈格孢屬、瓶梗青霉屬、青霉屬和鐮孢霉屬。

3 討論

從無(wú)花果中分離出64株內(nèi)生真菌，綜合生物測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，內(nèi)生真菌FL28菌株活性較好，其發(fā)酵液和菌絲體提取物均對(duì)5種測(cè)試菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的生物活性，因此本實(shí)驗(yàn)下一步將對(duì)這株內(nèi)生真菌進(jìn)行大量發(fā)酵，從其代謝產(chǎn)物中分離出化合物，并對(duì)分離出的化合物進(jìn)行活性測(cè)定和結(jié)構(gòu)鑒定，以期能得到高活性的化合物。

由于產(chǎn)物抑菌實(shí)驗(yàn)涉及到產(chǎn)物稀釋溶劑是否抑制測(cè)試菌的生長(zhǎng)狀況，故實(shí)驗(yàn)設(shè)置了溶劑丙酮對(duì)5種測(cè)試菌的對(duì)照，結(jié)果顯示，丙酮對(duì)5種測(cè)試菌均無(wú)抑制作用。由此可見，無(wú)花果分離的大部分內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物具有不同程度的抑菌能力，尤其是有些內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的抑菌效果非常好，具有廣譜抗菌性，表現(xiàn)出具有一定的應(yīng)用潛力，為新型抗菌物質(zhì)的開發(fā)提供了豐富的資源。因此，有必要對(duì)該植物內(nèi)生真菌進(jìn)行系統(tǒng)的深入研究。

［1］李彬成.無(wú)花果杏果抽提物抗癌療效顯著［J］.國(guó)外科技，1987(4):32.

［2］毛新偉，陳友地，楊倫，等.無(wú)花果抗癌研究綜述［J］.林產(chǎn)化工通訊，1998(5):13－15.

［3］馬養(yǎng)民，馮成亮.植物內(nèi)生真菌抗腫瘤活性成分研究進(jìn)展［J］.有機(jī)化學(xué)，2009，29(8):1182－1191.

［4］孫劍秋，郭良棟，臧威.等藥用植物內(nèi)生真菌及活性物質(zhì)多樣性研究進(jìn)展［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2006，26(7):1505－1519.

［5］Petrini O.Fungal endophytes of tree leave//Andrews J H，Hirano S S，eds.Microbial Ecology of Leaves.New York:Springer－Verlag，1991:179－197.

［6］鄒文欣，譚仁祥.植物內(nèi)生菌研究新進(jìn)展［J］.植物學(xué)報(bào)，2001，43(9):881－892.

［7］Tan R T，Zou W X.Endopytes:a rich source of functional metabolites［M］.Natural Product Reports，2001，48:448－459.

［8］張弘弛，馬養(yǎng)民，劉瑞，等，無(wú)花果內(nèi)生真菌的研究Ⅰ.抗植物病原真菌活性的篩選［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)2007，16(2):232－236.

［9］施巧琴，吳松剛.工業(yè)微生物育種學(xué)［M］.第二版.北京:科

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表1 內(nèi)生真菌發(fā)酵液提取物對(duì)5種測(cè)試菌的抑菌效果

［10］魏景超.真菌鑒定手冊(cè)［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1982:129－649.

［11］H L巴尼特，B B亨特著，沈崇堯譯.半知菌屬圖解［M］.北京:科學(xué)出版社，1977:41－197.

Screening of antifungal activities of endophytic fungi from Ficus carice

ZHANG Hong－chi1，MA Yang－min2，*，LIU Rui1
(1.College of Agronomy and Life Science，Shanxi Datong University，Datong 037009，China;2.College of Chemistry＆Chemical Engineering，Shaanxi University of Science＆Technology，Xi’an 710021，China)

Sixty four strains of endophytic fungi were isolated from roots，stems and leaves of Ficus carice and their antifungal activities against Staphylococcus aureus，Escherichia coli，Saccharomyces albicans，Rhodotorula sp，Penicilliumsp.were tested.These strains with higher inhibitory activity were identified and they were proved to belong to Alternaria sp.，Penicillium sp.，F(xiàn)usrium sp.and so on.The results indicated that the antifungal actions of FL28 was worth further studying.

Ficus carice;endophytic fungi;bioactivity;identification

TS255.1

A

1002－0306(2011)04－0166－04

2009－12－23 *通訊聯(lián)系人

張弘弛(1980－)，男，在讀博士，主要從事微生物代謝產(chǎn)物的研究。

國(guó)家自然科學(xué)基金(20772075);山西大同大學(xué)校級(jí)科研項(xiàng)目(2009Q1)資助。

表2 無(wú)花果內(nèi)生真菌菌絲丙酮提取物的抑菌效果