HPLC 法測定頭花蓼中槲皮素與山奈酚的含量

李雨生，王祥培，萬德光，吳紅梅

頭花蓼為蓼科植物頭花蓼(Polygonum capitatum Buch．—Han．ex D．Don)的干燥全草或地上部分，主產(chǎn)于貴州、云南、四川、西藏、廣西等省區(qū)。我國民族地區(qū)常將頭花蓼用于治療泌尿系統(tǒng)感染、血尿、濕疹、腎盂腎炎、膀胱炎、尿路結(jié)石、風(fēng)濕痛、跌打損傷、痄鰓、瘡瘍、腹瀉和痢疾等［1－2］。其中黃酮類成分為其主要成分［3－4］。目前文獻(xiàn)報道［5－8］測定了不同產(chǎn)地頭花蓼中總黃酮、沒食子酸、槲皮苷、槲皮素的含量，但同時測定不同產(chǎn)地野生與栽培頭花蓼中槲皮素與山奈酚的含量未見報道。本實驗采用高效液相色譜法同時測定12批頭花蓼中槲皮素與山奈酚的含量，方法靈敏，數(shù)據(jù)穩(wěn)定，可為評價不同產(chǎn)地野生與栽培頭花蓼質(zhì)量提供參考。

1 儀器與材料

日本島津LC－10AT高效液相色譜儀，SPD－10A紫外檢測器，浙大智達(dá)N2000色譜工作站，SB2200型超聲清洗器(上海必能信超聲有限公司)。

槲皮素(批號081－90003)、山奈酚(批號0861－200002)對照品均為中國藥品生物制品檢定所提供。甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純，水為重蒸鎦水。頭花蓼藥材:共12批樣品，分別產(chǎn)自貴州、四川、云南、西藏等地，均由貴陽中醫(yī)學(xué)院王祥培副教授教授鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Alltima C18(5 μm，4.6 mm×250 mm);柱溫:室溫;流動相為:甲醇－0.4%磷酸(50∶50);流速:0.8 mL·min－1;檢測波長:360 nm。理論塔板數(shù)按槲皮素、山奈酚計算應(yīng)不低于4000，在上述色譜條件下，對照品和樣品的色譜圖見圖1。

2.2 線性關(guān)系的考察

精密稱取槲皮素對照品10.8 mg、山奈酚對照品5.1 mg，各加甲醇溶解定容至100 mL，作為貯備溶液。精密吸取槲皮素貯備液10 mL、山奈酚貯備液5 mL混合，加甲醇定容至50 mL，搖勻，即得混合對照品溶液。精密吸取混合對照品溶液 1、3、6、9、12、15、18 μL，依次進(jìn)樣，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，得槲皮素回歸方程為:Y=1E+06x－1779.8，r=0.9998，線性范圍為 0.0216 μg ～ 0.389 μg。山奈酚為:Y=2E+06x+1758.1，r=0.9993，線性范圍 0.0051 μg ～0.0918 μg。

2.3 水解時間的考察

取西藏墨脫產(chǎn)頭花蓼粉末0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇－25%鹽酸溶液(4∶1)混合液25 mL，稱定重量，置水浴中加熱回流提取(分別進(jìn)行0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h 的時間考察)，放冷，稱重，用提取液補足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液5 mL至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。按2.1項下色譜條件，分別進(jìn)樣對照品與供試品溶液10 μL測定峰面積，并計算其含量，數(shù)據(jù)結(jié)果見表1。

表1 酸水解時間考察結(jié)果(n=3)

2.4 供試品溶液制備

取頭花蓼細(xì)粉0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇－25%鹽酸溶液(4∶1)混合液25 mL，稱定重量，置水浴中加熱回流1.0 h，放冷，稱重，用提取液補足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液5 mL至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5 精密度試驗

吸取對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，結(jié)果槲皮素、山奈酚峰面積的RSD分別為0.96%、1.27%。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別在 0、1、2、4、8、12 h 進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果槲皮素、山奈酚峰面積的RSD分別為1.45%、1.26%。表明供試品溶液在0～12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖1 頭花蓼的HPLC色譜圖

2.7 重復(fù)性試驗

取同批藥材5份，精密稱定，按2.3項下供試品溶液制備方法制備并測定，槲皮素平均含量為0.529%，RSD為1.12%;山奈酚平均含量為0.033%，RSD為1.95%。

2.8 回收率試驗

取已知含量頭花蓼粉末6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別添加濃度為 0.108、0.051 mg·mL－1槲皮素、山奈酚對照品溶液10 mL、2 mL，按2.3項下供試品溶液制備方法制備并測定，計算，槲皮素、山奈酚的平均回收率分別為97.37%、97.09%，其RSD分別為1.19%、1.88%，表明該方法回收率較好。結(jié)果見表2、表3。

表2 槲皮素回收率試驗結(jié)果

表3 山奈酚回收率試驗結(jié)果

2.9 樣品含量測定

精密吸取對照品溶液與12批頭花蓼藥材供試品溶液各10 μL，按上述色譜條件測定，并計算槲皮素、山奈酚的含量。結(jié)果見表4。

表4 不同地區(qū)頭花蓼中槲皮素與山奈酚含量(n=3)

3 討論

2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》只規(guī)定了頭花蓼藥材中槲皮素含量。本研究同時進(jìn)行了槲皮素與山奈酚的含量測定，在上述色譜條件下，待測成分與相鄰峰達(dá)到基線分離，且回收率高，重復(fù)性好，為更好地控制頭花蓼藥材及其制劑的內(nèi)在質(zhì)量提供了依據(jù)。在檢測樣品的制備方法上，比較了加熱回流0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h，結(jié)果1 h 以上，黃酮苷水解基本完全，鹽酸的濃度不宜再高，酸性太強對儀器和色譜柱腐蝕作用大。

根據(jù)實驗的數(shù)據(jù)結(jié)果可知，產(chǎn)于貴州盤縣的野生頭花蓼中槲皮素、山奈酚含量較高，貴州施秉栽培的頭花蓼較四川成都栽培頭花蓼的槲皮素、山奈酚含量高，但所收集的12批樣品中槲皮素的含量均大于0.1%，均符合2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定，可為頭花蓼資源的開發(fā)、利用提供數(shù)據(jù)參考依據(jù)。

致謝

西藏墨脫縣墨脫鎮(zhèn)人民政府王祥森同志提供西藏樣品。

［1］ 全國中草藥匯編編寫組．全國中草藥匯編(下冊)［M］．北京:人民出版社，1978:282．

［2］ 江蘇新醫(yī)學(xué)院編．中藥大詞典(上冊)［M］．上海:上海人民出版社，1977:611．

［3］ 李勇軍，駱宏豐，王永林，等．頭花蓼黃酮類化學(xué)成分的研究［J］．中國藥學(xué)雜志，2000，35(5):300．

［4］ 萬德光．中藥品質(zhì)研究—理論、方法與實踐［M］．上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，2008:333．

［5］ 王祥培，萬德光，王祥森，等．不同產(chǎn)地野生與栽培頭花蓼中總黃酮的含量分析［J］．時珍國醫(yī)國藥，2006，17(9):1713．

［6］ 楊立勇，王祥培，吳紅梅，等．HPLC測定不同產(chǎn)地的頭花蓼中槲皮苷的含量［J］．貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，31(4):67．

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［8］ 吳紅梅，賀祝英，王祥森，等．高效液相色譜法測定頭花蓼中沒食子酸與槲皮苷的含量［J］．時珍國醫(yī)國藥，2009，20(1):18．