陰虛火旺型OLP 差異表達(dá)miRNAs 靶基因信號(hào)通路調(diào)控分析

顏家渝，黃映紅，曾潔萍

口腔扁平苔蘚(Oral Lichen Panus，OLP)是常見的非感染性口腔粘膜病變，具有發(fā)病率高、病程遷延難愈、有癌變傾向等特點(diǎn)。OLP主要發(fā)生人群是40歲以上的成年人，但是年輕人和兒童也會(huì)發(fā)生，約占患者總數(shù)的2% ～3%，OLP在成人中的患病率約為0.51%［1］。OLP病程遷延，易反復(fù)發(fā)作，部分反復(fù)發(fā)作的病人可發(fā)展為口腔鱗癌。由于日漸增多的OLP癌變病例的危險(xiǎn)報(bào)告被提出，因此WHO已將OLP定義為癌前狀態(tài)疾病［2］。OLP發(fā)病機(jī)制的探討一直是口腔醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。有研究表明，OLP存在著多基因表達(dá)調(diào)控的改變，可能與其發(fā)生和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)［3～4］。據(jù)文獻(xiàn)綜合表明［5～8］，陰虛火旺是 OLP 最常見的中醫(yī)臨床證候。此型通常伴口腔粘膜充血，糜爛，易發(fā)生癌變［9］，故本研究重點(diǎn)為陰虛火旺型的OLP。

miRNA是一種極短的，在體內(nèi)自然存在的約含21～22個(gè)堿基的RNA分子，是由Dicer酶加工具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70～90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體而來，miRNA通過和靶基因mRNA互補(bǔ)序列配對(duì)引導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)降解mRNA或抑制蛋白的翻譯。miRNA在細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡、血細(xì)胞分化、同源異形盒基因調(diào)節(jié)、神經(jīng)元的極性、胰島素分泌、大腦形態(tài)形成、心臟發(fā)生、胚胎后期發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用。因此，為進(jìn)一步探明OLP患者的特異性基因表達(dá)調(diào)控，本研究運(yùn)用基因芯片技術(shù)篩選OLP相關(guān)的miRNAs，探索口腔扁平苔蘚的中醫(yī)證候研究方法，探討陰虛火旺型口腔扁平苔蘚的基因表達(dá)特征及靶基因信號(hào)通路調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

白細(xì)胞保存液(孝感奧華醫(yī)療科技有限公司)、EDTA(江西省容和實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司)、紅細(xì)胞裂解液(C3702，江蘇海門市碧云天生物技術(shù)研究所)、mir-Vana RNA Isolation Kit(美國(guó) Ambion公司)、miRNAs芯片SANGER11.0版本(美國(guó)Affymetrix公司)等。

超凈工作臺(tái)SW－CJ－1F(蘇州市安泰空氣技術(shù)有限公司)、Heraeus冷凍離心機(jī)(Me gafu ge1.0R，德國(guó))、eppendorf加樣槍(1403853，德國(guó))、SANYO 超低溫冰箱(MDF－382E，日本)等。

1.2 臨床病例樣本采集

1.2.1 臨床病例收集

2008年9月至2010年8月在成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院口腔粘膜病專病門診，并經(jīng)臨床及病理學(xué)檢查確診的OLP患者20例，按中醫(yī)辨證分型［10］，篩選陰虛火旺型口腔扁平苔蘚病例3例，其中男2例，女性1例。對(duì)照組3例健康者，其中男性2例，女性1例。各組均排除感染性、心血管、自身免疫、過敏性、腫瘤、精神性疾病等。

1.2 .2 樣本采集

晨空腹常規(guī)靜脈采血2 mL，加入EDTA抗凝，4℃保存待用。在超凈工作臺(tái)上分別吸取6 mL紅細(xì)胞裂解液到6個(gè)15 mL離心管，離心管編號(hào)1～6號(hào)。將回復(fù)到室溫的抗凝全血搖勻后，吸取2 mL分別加到6個(gè)離心管中，顛倒6～8次，并倒置輕彈管壁混勻。室溫放置5分鐘并輕彈數(shù)次幫助裂解紅細(xì)胞，搖勻，3000 rpm離心5分鐘，棄上清液，留下管底白細(xì)胞團(tuán)和大約10 μL的殘留上清液。6個(gè)離心管均加入紅細(xì)胞裂解液重復(fù)離心1次，吸凈上清，加入mirVana RNA Isolation Kit 1 mL，吹勻并移入12個(gè)凍存管，對(duì)應(yīng)離心管分別編號(hào) 1－1、1－2、2－1、2－2、3－1、3－2、4－1、4－2、5－1、5－2、6－1、6－2，－80℃保存。

1.3 miRNAs微陣列分析

芯片采用美國(guó)Affymetrix公司生產(chǎn)的miRNA芯片SANGER11.0版本，每片含1769條探針，其中人類miRNA700個(gè)。

1.3.1 芯片制作與掃描

提取TotleRNA，采用凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)質(zhì)量檢測(cè)，探針標(biāo)記與雜交，洗片后晾干后掃描。

1.3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SAM軟件，P值小于0.05視為表達(dá)有差異。

2 結(jié)果

2.1 樣品RNA的質(zhì)量判定

TotleRNA質(zhì)量檢測(cè)及分離純化的小分子RNA均符合miRNA芯片要求。探針標(biāo)記與雜交、洗片過程質(zhì)控合格，掃描數(shù)據(jù)可分析。

2.2 差異表達(dá)的miRNAs

尋找到5個(gè)OLP患者和正常人有表達(dá)差異的miRNA(表1)。

表1 差異表達(dá)的miRNAs列表

2.3 hsa－miR－18a miRNA基因相關(guān)的12個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義靶基因通路(表2)

2.4 hsa－miR－99b miRNA基因相關(guān)的2個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義靶基因通路(表3)

3 討論

OLP病因及發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，一般認(rèn)為與精神、內(nèi)分泌、免疫、感染等全身因素有關(guān)。OLP發(fā)病機(jī)制的探討一直是口腔醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。有研究表明，OLP存在著多基因表達(dá)調(diào)控的改變，可能與其發(fā)生及疾病的轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)［11］。范媛［12］等利用基因芯片篩選出OLP相關(guān)的差異表達(dá)基因213條，主要涉及免疫相關(guān)基因，代謝相關(guān)基因，以及DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)基因。許彥枝［13］等則應(yīng)用含有332050個(gè)位點(diǎn)的人類基因組芯片進(jìn)行雜交，篩選出114條差異表達(dá)基因，并總結(jié)了ERBB3、SYN2、GIT1、CD72等幾條基因在OLP發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用。同時(shí)，許彥枝［14］等也研究了OLP的表達(dá)通路，結(jié)論為應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片可初步篩選出OLP差異表達(dá)基因和通路，OLP發(fā)生、發(fā)展過程中存在著多個(gè)不同基因及多條功能通路表達(dá)調(diào)控的改變。但目前尚無對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的重要環(huán)節(jié)miRNA的分析。探討OLP與miRNA的相關(guān)性，將為OLP的分子機(jī)制學(xué)研究開拓全新的思路。

表2 hsa－miR－18a miRNA對(duì)應(yīng)12個(gè)靶基因通路列表(p－value＜0.01)

表3 hsa－miR－99b miRNA對(duì)應(yīng)2個(gè)靶基因通路列表(p－value＜0.05)

miRNA是一類新近發(fā)現(xiàn)的，在基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起重要作用的小分子。在高等真核生物中廣泛表達(dá)的miRNA是經(jīng)過Dicer加工之后的一類非編碼的小RNA分子。在哺乳動(dòng)物中，miRNA通常在翻譯水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)，miRNA的數(shù)量與每個(gè)位點(diǎn)上翻譯沉默的水平是協(xié)同相關(guān)的［15］，由于互補(bǔ)序列的存在，miRNA能夠與特異的mRNA3＇非翻譯區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制，從而起到對(duì)基因表達(dá)負(fù)調(diào)節(jié)作用或基因沉默［16］。雖然miRNA基因在人類的基因組中只占很小一部分，但它是機(jī)體發(fā)育和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。每個(gè)miRNA可有多個(gè)靶基因，多個(gè)miRNA也可調(diào)控同一靶基因［17］，這一特點(diǎn)體現(xiàn)了miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的經(jīng)濟(jì)性和精密性。

經(jīng)Kegg及Biocarta數(shù)據(jù)庫(kù)分析，hsa－miR－18a相關(guān)的有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的信號(hào)通路共12條，包括CD40L信號(hào)通路、TNFR2信號(hào)通路、NF－KB信號(hào)通路、p53信號(hào)通路等。hsa－miR－18a的上調(diào)，使相應(yīng)信號(hào)通路效應(yīng)物的活性抑制或濃度改變。其中TNFR2信號(hào)通路的抑制，可能與OLP病變部位細(xì)胞凋亡減弱有關(guān)。而p53信號(hào)通路抑制，導(dǎo)致抑癌基因p53表達(dá)下調(diào)，與細(xì)胞惡性增殖密切相關(guān)，GirodS 與 Rajaram G［18～19］認(rèn)為p53基因突變可能與口腔黏膜癌變的早期階段有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析指出hsa－miR－99b相應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義信號(hào)通路包括細(xì)胞粘多糖(肝素)合成和細(xì)胞粘多糖降解通路兩條。有研究表明，CD淋巴細(xì)胞通過產(chǎn)生肝素酶穿過黏膜下層基板區(qū)，形成淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)帶，介導(dǎo)扁平苔蘚的炎癥反應(yīng)［20］。故根據(jù)本研究結(jié)果可推測(cè)hsa－miR－99b的表達(dá)下調(diào)可與OLP病變部位粘多糖成分肝素的合成分解紊亂有關(guān)。

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