5,7-DMF對MDA-MB-453細(xì)胞凋亡和14-3-3σ基因表達(dá)的影響

劉勝姿，劉英姿，全梅芳，譚宇婷，周 源

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410013）

白楊素是從多種植物、蜂膠和蜂蜜中提取的一種具有廣泛生物活性的黃酮類化合物，實(shí)驗(yàn)證明白楊素具有廣譜抗腫瘤活性，但因其在腸道吸收甚少，并且5,7-位羥基在體內(nèi)易被迅速糖基化代謝以致活性降低，使其臨床應(yīng)用受到限制[1]。有研究顯示，無羥基的黃酮結(jié)構(gòu)分子能有效促進(jìn)HT-29細(xì)胞的分化和凋亡[2]，證明羥基并不是白楊素抗腫瘤作用所必須的基團(tuán)。Wen等證明，多酚類化合物甲基化后腸道吸收率更高，肝代謝更穩(wěn)定，更有利于開發(fā)成有效的抗癌藥物[3]。我們先前的實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，與先導(dǎo)化合物白楊素相比，5,7-二甲氧基白楊素對體外培養(yǎng)的人胃癌SGC-7901細(xì)胞和人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞生長具有更強(qiáng)的抑制作用[4]。

14-3-3σ是14-3-3蛋白家族中的一個成員，作為一個細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子，14-3-3σ的活化可以引起細(xì)胞周期G2/M期阻滯從而發(fā)揮抑癌基因的作用[5]。而14-3-3σ基因的缺乏或甲基化失活在乳腺癌的發(fā)病中起著重要作用[6]。我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，MDA-MB-453細(xì)胞株為一株14-3-3 σ基因甲基化失活的人乳腺癌細(xì)胞株。本文旨在研究自主設(shè)計合成的新型白楊素類似物5,7-DMF誘導(dǎo)人乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞凋亡作用，并探討其調(diào)控過程是否與DMF通過表觀遺傳學(xué)機(jī)制抑制14-3-3σ基因甲基化和上調(diào)14-3-3σ蛋白表達(dá)，復(fù)活14-3-3σ基因功能有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 試劑

5,7-二甲氧基黃酮 (5,7-DMF,Sigma公司;分子量:282,性狀:白色粉末,純度：98%)；5-氮雜胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR,Sigma公司)；碘化丙啶(PI,Sigma 公司)；TRIzol(美國 Invitrogen公司)，基因組提取和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (美國Promega公司)，14-3-3σ 和 β-actin 單克隆抗體(美國 Santa Cruz公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（中國武漢市），用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，加100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素，置于37℃，5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)分析

按照先前文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行，用EPICS XL型流式細(xì)胞儀(美國COULTER公司)測定10000個細(xì)胞的DNA含量，SYSTEM II軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.4 基因組DNA提取

按A1120試劑盒說明書操作(美國Promega公司)，DNA純化后，在紫外分光光度A260/280處檢測，計算其純度和含量。樣品于-20℃保存。

1.5 甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)

按照文獻(xiàn)[8]報道合成引物，甲基化引物(M)上游：5'-TGGTAGTTTTTATGAAAGGCGTC-3'，下游：5'-CCTCTAACCGCCCACCACG-3'，產(chǎn)物片段105 bp，非甲基化引物(U)上游：5'-ATGGTAGTTTTTATGAAAGGTGTT-3'， 下 游 ：5'-CCCTCTAACCACCCACCACA-3'，產(chǎn)物片段107 bp。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件按文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測

TRlzol提取總RNA和逆轉(zhuǎn)錄cDNA的合成按試劑盒說明書操作。

用prime primier 5.0軟件自行設(shè)計 14-3-3σ引物 (上游：5'-TGCGAAGAGCGAAACCTGC-3'，下游：

5'-CTGTTGGCGATCTCGTAGTGG-3'，產(chǎn)物片段446 bp)和內(nèi)參照β-actin引物(上游：5'-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3'，下游：5'-GATTTTCTGCGCAAGTTAGG-3'，產(chǎn)物片段 520 bp)。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件按文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

1.7 Western blotting分析

Western blotting分析按照先前文獻(xiàn)[7]描述的方法完成。抗人14-3-3σ和β-actin單克隆抗體作為一抗。用增強(qiáng)型ECL蛋白質(zhì)印跡分析系統(tǒng)進(jìn)行目的條帶信號的檢測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入SPSS 15.0 for windows evaluation軟件，建立數(shù)據(jù)庫，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用One Way ANOVA行方差分析。P＜0.05為統(tǒng)計學(xué)意義顯著標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 5,7-DMF對人乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞活性的影響

MTT 比色測定結(jié)果表明，0.1～30.0 μmol/L 的5,7-DMF顯著抑制人乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞增殖活性,其抑制作用隨濃度的增加而增強(qiáng)。5,7-DMF(10.0 μmol/L)對乳腺癌 MDA-MB-453 細(xì)胞的抑制作用較同濃度的去甲基化藥物5-Aza-CdR強(qiáng)(表 1)。

2.2 5,7-DMF對人乳腺癌MDA-MB-453與MCF-7細(xì)胞凋亡率的影響

表1 5,7-DMF對人乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞活性的影響(mean±SD,n=3)

PI染色FCM分析結(jié)果顯示，5,7-DMF (5、10和20 μmol/L)處理 48 h，以濃度依賴的方式誘導(dǎo)MDAMB-453細(xì)胞凋亡率增加 (表2)。其作用效價強(qiáng)度大于5-Aza-CdR。

表2 5,7-DMF對人乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞凋亡率的影響(mean±SD,n=3)

2.3 5,7-DMF抑制人乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞14-3-3σ基因甲基化

如圖 1所示，10 μmol/L 5,7-DMF與 5-Aza-CdR分別處理72 h，均能有效抑制MDA-MB-453細(xì)胞14-3-3σ基因甲基化。

圖1 5,7-DMF抑制人乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞14-3-3σ基因甲基化

2.4 5,7-DMF上調(diào)人乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞14-3-3σ基因mRNA表達(dá)水平

如圖 2所示，10 μmol/L 5,7-DMF 與 5-Aza-CdR分別處理72 h，均能顯著提高M(jìn)DA-MB-453細(xì)胞14-3-3σ基因mRNA表達(dá)水平。

圖2 5,7-DMF上調(diào)人乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞14-3-3σ基因mRNA表達(dá)

2.5 5,7-DMF上調(diào)人乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞14-3-3σ蛋白表達(dá)水平

如圖3所示，5,7-DMF(1,5,10μmol/L)處理72小時，均能提高M(jìn)DA-MB-453細(xì)胞14-3-3σ蛋白表達(dá)水平，并呈濃度依賴性，其中10 μmol/L 5,7-DMF作用效果與同濃度5-Aza-CdR相當(dāng)。

圖3 5,7-DMF上調(diào)人乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞14-3-3 σ 蛋白表達(dá)

3 討論

有資料顯示，乳腺癌已成為全球婦女發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1]，我國乳腺癌的發(fā)生率也呈逐年上升趨勢。目前，治療乳腺癌的方法主要有：手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療。而化學(xué)藥物治療在乳腺癌綜合治療中仍然占主導(dǎo)地位，但因其嚴(yán)重的毒副作用極大地降低了它的臨床應(yīng)用價值。因此，尋找乳腺癌特異性腫瘤分子標(biāo)志以及高效、低毒的新的分子靶向治療藥物具有重大的社會效益和臨床應(yīng)用前景。

14-3-3σ是人類乳腺上皮的一個特異性標(biāo)記，它的表達(dá)可介導(dǎo)DNA損傷通過p53依賴途徑所誘導(dǎo)[10]。當(dāng)DNA發(fā)生損傷后，p53被激活磷酸化，磷酸化的p53可以和14-3-3σ啟動子上游長度為1.8kb的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)結(jié)合，從而誘導(dǎo)14-3-3σ的表達(dá)，引起細(xì)胞周期G2/M期阻滯，抑制細(xì)胞的生長。Yang等研究表明，14-3-3σ可以穩(wěn)定p53的表達(dá)并且增加p53的轉(zhuǎn)錄活性，提示p53和14-3-3σ之間存在著一個正反饋調(diào)節(jié)通路[11]。在乳腺癌的發(fā)病進(jìn)程中頻繁出現(xiàn)14-3-3σ基因缺乏或其表達(dá)下調(diào)[10]?？梢?4-3-3σ基因的低表達(dá)在乳腺癌的發(fā)病中起著重要作用[6]。

通過本文的研究，我們證明自主設(shè)計合成的新型白楊素類似物5,7-DMF以濃度依賴的方式抑制人乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞活性并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為了闡明5,7-DMF誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制，我們分析了5,7-DMF處理24 h的MDA-MB-453細(xì)胞中14-3-3σ基因的甲基化、mRNA和蛋白表達(dá)水平，證明5,7-DMF通過通過表觀遺傳學(xué)機(jī)制即抑制14-3-3σ基因甲基化和上調(diào)14-3-3σ mRNA和蛋白表達(dá)，復(fù)活14-3-3σ基因功能，從而抑制MDA-MB-453細(xì)胞系生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡?？傊?，5,7-DMF能抑制人乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這與其抑制14-3-3σ基因甲基化和上調(diào)14-3-3σ蛋白表達(dá)有關(guān)。

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