十種中藥提取物與抗生素合用對銅綠假單胞菌最小抑菌濃度影響的體外實驗

趙 敏，譚鋼文，唐小異，龍靈芝，周 源

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410006）

銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginos，PAE)為醫(yī)院內(nèi)重要的條件致病菌之一，人體免疫力低下時，如長期應(yīng)用激素類藥物、抗腫瘤藥物、免疫抑制劑、嚴重創(chuàng)傷或醫(yī)療操作如氣管切開等，更容易感染PAE菌且死亡率高[1-2]。廣譜抗生素的大量應(yīng)用使銅綠假單胞菌耐藥率增高，給臨床治療帶來困難[3-4]。二十世紀80年代開始，中草藥作為天然、毒、副作用小的細菌耐藥性抑制劑，顯示了良好的應(yīng)用前景。黃連具廣譜抗菌活性，黃芪是常見的益氣健脾中藥之一，具有明顯的提高機體免疫和促進腸胃功能等作用[5-6]。本研究對黃連等10種中藥材進行常規(guī)提取，觀察各提取物處理后，抗生素對銅綠假單胞菌抑制作用的變化。

1 材料與方法

1.1 藥品

氨芐西林鈉注射液(1.0g/支，哈藥集團制藥總廠，批號 A080515713)、頭孢他啶注射液(1.0g/支，山西威奇達藥業(yè)有限公司，批號 20081209)。黃柏、黃芩、槐花、連翹、防己、黃連、苦參、穿心蓮、蛇床子、麻黃等中藥購自湖南高橋大市場藥材公司亞飛經(jīng)營部并經(jīng)本院生藥室鑒定。

1.2 菌種及儀器

耐藥銅綠假單胞菌由本院微生物實驗室提供；Tu-1800SPC紫外可見分光光度計，YC7124真空泵，HH-S恒溫水浴鍋，YXQ-2S-S0S1高壓蒸汽滅菌器，METTLER TOLEDO PL403電子精密天平；YXQ-LS-50SI立式壓力蒸汽滅菌器，eppendorf 5804R冷凍離心機，PYX-150S-A生化培養(yǎng)箱，SW-CJ-2F凈化工作臺。

1.3 方法

1.3.1 中草藥提取物的制備

黃芩、黃芪、槐花、連翹、防己等采用乙醇回流法制備：中藥材經(jīng)自然風(fēng)干、粉碎，過100目篩，各稱取50 g，加50%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并濾液，重結(jié)晶后溶于蒸餾水，濃縮(相當于原藥0.5 g/mL)、高壓蒸汽滅菌，編號后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。黃柏采用堿提法，常壓加熱煎煮法制備黃連、麻黃、苦參、蛇床子、穿心蓮提取物，濃縮至1:1(相當于1 g/mL)，十種中藥提取物經(jīng)無菌濾紙濾過、除菌，裝瓶4℃保存?zhèn)溆肹7]。

1.3.2 平板打孔法測定銅綠假單胞菌對抗生素、中藥提取物的敏感性

將銅綠假單胞細菌劃線接種于瓊脂培養(yǎng)平板上，分別加入稀釋濃度為1 g/mL的氨芐西林、頭孢他啶、慶大霉素、阿米卡星注射液，十種中藥提取物，37℃恒溫培養(yǎng)18 h，觀察有無抑菌環(huán)。以平板打孔法定性測試藥物對銅綠假單胞細菌有無抑制作用。

1.3.3 對倍稀釋法測定抗生素的最小抑菌濃度

取10個透明離心管，各加入2 mL MH液體培養(yǎng)基，往1號管中加入一定濃度的抗生素溶液，震蕩均勻后吸取2 mL加入2號管，依次類推至10號管震蕩均勻后，吸取2 mL棄去，加入稀釋菌液50 μL，37℃恒溫培養(yǎng)18 h，測定多次二倍梯度稀釋后，各抗生素對銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度(MIC 1)。

1.3.4 中藥提取液對銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度

取10個透明離心管，分別加入1 mL對應(yīng)的中藥和1 mL MH液體培養(yǎng)基，加入稀釋菌液50 μL，37℃恒溫培養(yǎng)18 h，離心后取沉淀，加MH培養(yǎng)基稀釋。發(fā)現(xiàn)黃芩、連翹藥液培養(yǎng)基中無細菌生長，測黃芩和連翹提取物的最小抑菌濃度(MIC 2)。

1.3.5 平板打孔法定性檢測中藥處理后是否恢復(fù)耐藥菌對抗生素的敏感性

用10個MH平板分別涂上原菌或經(jīng)中藥處理的銅綠假單胞菌，每板打三個孔，分別標記為阿米卡星、氨芐西林和頭孢他啶，加入對應(yīng)的抗生素溶液100 μL。37℃恒溫培養(yǎng)18 h，觀察抑菌環(huán)大小，確定中藥是否恢復(fù)了細菌對抗生素的敏感性。

1.3.6 二倍梯度稀釋法比較抗生素對經(jīng)10種中藥處理菌與原菌的最小抑菌濃度

從1.3.4得到可使抑菌環(huán)增大的中藥和/或抗生素的組合，加入的菌液按10種中藥培養(yǎng)菌和原菌分為11個組。培養(yǎng)后觀察各管中有無細菌生長，確定各組藥物的抗菌作用(MIC 3)，反復(fù)以二倍梯度稀釋法觀察中藥單用或與抗生素合用后MIC的變化。

2 結(jié)果

2.1 單用中藥提取物的抗銅綠假單胞菌作用

平板打孔法測定，分別單獨加入黃柏、槐花、防己、黃連、苦參、穿心蓮、蛇床子、麻黃等中藥提取物的培養(yǎng)基均無抑菌環(huán)出現(xiàn)，提示以上中藥的提取物單用對銅綠假單胞菌無明顯抑制作用。

2.2 單用抗生素對抗銅綠假單胞菌作用

二倍梯度稀釋法測定，阿米卡星、氨芐西林和頭孢他啶對耐藥銅綠假單胞菌有抑制作用，最小抑菌濃度分別為0.050，0.008，0.001 g/mL，頭孢他啶抑菌作用最強。而慶大霉素原濃度藥液(1mL:4萬單位)也不能抑制銅綠假單胞菌生長，故后續(xù)實驗棄用。結(jié)果見表1。

表1 抗生素對銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度(g/mL)

2.3 二倍梯度稀釋法測定黃芩和連翹提取物的最小抑菌濃度

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芩提取物經(jīng)三次二倍稀釋、連翹提取物經(jīng)四次二倍稀釋后，仍可產(chǎn)生抗菌作用。結(jié)果見表2。在后續(xù)實驗中采用0.125 g/mL黃芩或0.1125 g/mL連翹處理細菌培養(yǎng)基。

表2 黃芩和連翹提取物對銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度(g/mL)

2.4 平板打孔法測試十種中藥的提取物分別與抗生素、氨芐西林或頭孢他啶合用后，是否恢復(fù)細菌對抗生素的敏感性，測得抑菌環(huán)結(jié)果見表3。

表3 氨芐西林、頭孢他啶單用或與中藥提取物合用后的抑菌環(huán)直徑

結(jié)果顯示，氨芐西林和頭孢他啶對黃芩、連翹、黃連、穿心蓮、麻黃5種中藥處理后，抑菌環(huán)直徑大于單用一種抗生素產(chǎn)生的抑菌環(huán)(單用氨芐西林1.8 cm，單用頭孢他啶4.5 cm)，提示以上5種中藥可增加銅綠假單胞菌對氨芐西林和頭孢他啶的敏感性。

2.5 經(jīng)反復(fù)進行二倍梯度稀釋，測定最小抑菌濃度

結(jié)果顯示，經(jīng)黃芩處理后，氨芐西林對銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度降為0.004 g/mL，為單用時MIC(0.008 g/mL)的一半。而頭孢他啶經(jīng)15次二倍稀釋后仍呈現(xiàn)抗菌活性，最小抑菌濃度由單用時0.001g/mL降為3.87×10-6g/mL；經(jīng)黃連處理后，亦得到類似結(jié)果。提示黃芩或黃連可提高銅綠假單胞菌對氨芐西林的敏感性，黃芩或黃連可明顯提高銅綠假單胞菌對頭孢他啶的敏感性。見表4。

表4 黃芩、黃連和抗生素合用后的最小抑菌濃度(g/mL)

3 討論

銅綠假單胞菌對多種常用的抗菌藥物耐藥率較高，呈現(xiàn)逐年上升趨勢，耐藥機制包括產(chǎn)生多種滅活酶、外膜孔蛋白OprD2的缺失、外膜的通透性降低以及主動外排泵機制等。因銅綠假單胞菌具有多藥耐藥性的特點，故治療其所致感染可供選擇的有效抗菌藥物甚少[8]。用于逆轉(zhuǎn)細菌耐藥性的中藥多為清熱解毒、利濕通淋類藥物，如黃芪、黃柏、黃連、金銀花、馬齒莧、射干、大黃、五倍子、蒼術(shù)、石芽茶等以及相應(yīng)的復(fù)方制劑，如黃連解毒湯、三黃片、止痢靈等。近年的研究報道，黃芩、黃連、黃柏、連翹和千里光對產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)及持續(xù)高產(chǎn)AmpC酶菌株均有不同程度的抑制作用，黃芩抑菌效果較好，其次為黃連和千里光等[9]。最近研究報道，銅綠假單胞菌具有極強的生物膜形成能力，生物膜的形成可明顯降低其對抗菌藥物的敏感性甚至產(chǎn)生耐藥，常給臨床治療帶來很多困難，黃芩苷可抑制和破壞生物膜，并增強頭孢他啶對生物膜內(nèi)銅綠假單胞菌的抗菌活性。本研究采用平板打孔法及二倍梯度稀釋法研究了10種中藥提取物對銅綠假單胞菌的影響。實驗結(jié)果表明，黃芩、黃連處理后，氨芐西林和頭孢他啶對銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度顯著降低，提示黃芩、黃連與以上抗生素合用有協(xié)同抗菌作用，作用機理是否與影響銅綠假單胞菌生物膜的結(jié)構(gòu)或功能有關(guān)，需進一步研究證實。

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