八肋游仆蟲(chóng)中心蛋白N端半分子Loop區(qū)首個(gè)氨基酸的作用

趙 冰 段 煉 劉 文 趙亞琴 楊斌盛

(山西大學(xué)分子科學(xué)研究所，太原 030006)

八肋游仆蟲(chóng)中心蛋白N端半分子Loop區(qū)首個(gè)氨基酸的作用

趙 冰 段 煉 劉 文 趙亞琴 楊斌盛＊

(山西大學(xué)分子科學(xué)研究所，太原 030006)

本文通過(guò)分子生物學(xué)方法將八肋游仆蟲(chóng)中心蛋白N端半分子loop區(qū)的首個(gè)氨基酸，天冬氨酸Asp37和Asp73，分別突變?yōu)閹喾措姾傻馁?lài)氨酸。使用鋱敏化熒光、TNS疏水探針研究了八肋游仆蟲(chóng)中心蛋白N端半分子loop區(qū)的首個(gè)氨基酸的作用。結(jié)果表明：當(dāng)中心蛋白loopⅠ區(qū)37位的天冬氨酸突變?yōu)橘?lài)氨酸后，loopⅠ喪失了金屬離子結(jié)合能力，進(jìn)而影響了中心蛋白依賴(lài)于金屬離子的構(gòu)象變化；而loopⅡ區(qū)73位的天冬氨酸突變?yōu)橘?lài)氨酸后仍保持金屬離子結(jié)合能力，依賴(lài)于金屬離子的構(gòu)象變化減小。中心蛋白發(fā)揮大部分生物功能都依賴(lài)于金屬離子，這就表明loopⅠ區(qū)37位的天冬氨酸在中心蛋白發(fā)揮生物功能時(shí)起著重要作用，是不可缺少的。在10 mmol·L-1Hepes、pH 7.4、20 mmol·L-1KCl條件下，八肋游仆蟲(chóng)中心蛋白N端半分子loopⅡ與金屬離子 Tb3+和 Ca2+的結(jié)合常數(shù)分別為：KⅡ(Tb3+)=(8.31±0.18)×104L·mol-1和 KⅡ(Ca2+)=(0.94±0.12)×102L·mol-1，中心蛋白 N 端半分子的兩個(gè)金屬結(jié)合部位結(jié)合能力順序?yàn)椋孩瘢劲颉?/p>

中心蛋白；N端半分子；Tb3+；Ca2+；TNS

中心蛋白是分子量約為20 kDa的酸性蛋白，屬于高度保守的EF-Hand鈣結(jié)合蛋白超家族[1-2]。自從綠藻中心蛋白發(fā)現(xiàn)以來(lái)，這些蛋白在微管組織中心(MTOC)中時(shí)間和空間上的分布，以及這種蛋白在細(xì)胞循環(huán)調(diào)控中的重要作用就成了細(xì)胞生物學(xué)研究的內(nèi)容之一[2-6]。最初，中心蛋白被認(rèn)為是纖維的主要成分，參與核與鞭毛單細(xì)胞鞭毛器的連接，隨后發(fā)現(xiàn)，中心蛋白是中心粒、中心體以及有絲分裂紡錘體極體中廣泛存在的組成成分[3,7-8]。

八肋游仆蟲(chóng)中心蛋白(EoCen)與人中心蛋白HsCenl、HsCen2、HsCen3以及鈣調(diào)蛋白的同源性分別為60%、62%、66%和50%[9]。氨基酸序列分析表明EoCen由2個(gè)相對(duì)獨(dú)立的區(qū)域(N端和C端)組成，每個(gè)區(qū)域包含2個(gè)EF-Hand結(jié)構(gòu)和2個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)。由于每個(gè)EF-Hand的氨基酸序列都不同，這就決定了4個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)的性質(zhì)也不同[10]。例如人中心蛋白HsCen2的loopⅣ區(qū)有一個(gè)高親和位點(diǎn)[11-12]，而HsCen3則表現(xiàn)出不同的結(jié)合行為：它有3個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，其中1個(gè)位于N端區(qū)域，而且是1個(gè)Ca2+/Mg2+的混合結(jié)合位點(diǎn)[12-13]。本實(shí)驗(yàn)室過(guò)去的研究工作發(fā)現(xiàn)，八肋游仆蟲(chóng)中心蛋白的4個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)可分為兩類(lèi)，分別是C端熒光弱敏化的高親和位點(diǎn)和N端熒光強(qiáng)敏化的低親和位點(diǎn)，4個(gè)結(jié)合部位結(jié)合能力為Ⅳ＞Ⅲ＞Ⅰ，Ⅱ[14]。

圖1為鈣調(diào)蛋白N端半分子的2個(gè)EF-Hand結(jié)構(gòu)結(jié)合金屬離子前后的構(gòu)象變化[15]。中心蛋白結(jié)合金屬離子的結(jié)構(gòu)模式可能與鈣調(diào)蛋白類(lèi)似。

圖1 鈣調(diào)蛋白N端半分子結(jié)合金屬離子前后的構(gòu)象變化[15]Fig.1 Conformational change of N-terminal EF-Hand domain of CaM induced by Ca2+[15]

中心蛋白可能是一個(gè)鈣離子傳感器，在Ca2+飽和狀態(tài)下，中心蛋白與特定的靶蛋白相互作用來(lái)調(diào)控細(xì)胞活性。一般來(lái)說(shuō)，Ca2+的結(jié)合使得EF-Hand結(jié)構(gòu)的α螺旋發(fā)生改變，轉(zhuǎn)為以“開(kāi)放”的構(gòu)象存在，這樣就導(dǎo)致了疏水腔的暴露，進(jìn)而結(jié)合靶肽[13,16]。蛋白質(zhì)發(fā)揮功能時(shí)通常伴隨著構(gòu)象的變化，2-對(duì)甲苯胺基-6-萘磺酸(TNS)已經(jīng)被廣泛用于金屬離子誘導(dǎo)的中心蛋白構(gòu)象變化的探針[17]。本實(shí)驗(yàn)室過(guò)去的研究發(fā)現(xiàn)：中心蛋白結(jié)合金屬離子后，C端和N端發(fā)生的構(gòu)象變化是不同的，N端能暴露出比C端更多的疏水表面[18]。

中心蛋白loop區(qū)最規(guī)范的序列中都包含3個(gè)D(天冬氨酸)，目前所發(fā)現(xiàn)的EF-hand結(jié)構(gòu)中，第一位的D都是非常保守的，很少有第一位不是D的[16]。由于中心蛋白N端是高變區(qū)，有人預(yù)測(cè)它與不同中心蛋白的功能多樣性有關(guān)[3,11,19]。本文將中心蛋白N端半分子loop區(qū)的首個(gè)氨基酸天冬氨酸突變?yōu)橘?lài)氨酸，研究N端Ⅰ、Ⅱ結(jié)合部位結(jié)合能力的差異以及天冬氨酸在N端半分子構(gòu)象變化中的作用，從而探索N端半分子首個(gè)氨基酸在中心蛋白發(fā)揮生物功能中的作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(Hepes)；2-對(duì)甲苯胺基-6-萘磺酸 (TNS)(Sigma公司)；稀土氧化物Tb4O7，純度不低于99.99%(湖南稀土金屬材料研究所產(chǎn)品)；其他均為分析純?cè)噭?/p>

主要酶及生化試劑：限制性?xún)?nèi)切核酸酶BamHⅠ、SalⅠ、T4DNA連接酶，為Promega公司產(chǎn)品；Taq DNA聚合酶購(gòu)于大連TaKaRa公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒及DNA回收試劑盒購(gòu)于上海華舜生物工程有限公司；LB培養(yǎng)基所用的試劑Tryptone、Yeast Extract、Sodium Chloride 購(gòu) 于 上 海 Sangon 公司；核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)為MBI公司產(chǎn)品。

Hitachi F-2500和Hitachi-850熒光光譜儀、HP8453UV-Vis吸收光譜儀、Beckman酸度計(jì)、PM-10超濾膜、Eppendorf移液槍、Amicon Model 8010超濾器。

1.2 儲(chǔ)備液的配制

稀土溶液：將稀土氧化物(Tb4O7)用適量的濃鹽酸溶解，用雙蒸水配成pH=5～6的溶液備用，以二甲酚橙為指示劑，在pH=5.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液中用標(biāo)準(zhǔn)EDTA溶液滴定，測(cè)定其標(biāo)準(zhǔn)濃度。

TNS溶液：稱(chēng)取一定量的TNS，加入少量NaOH溶液溶解，三次蒸餾水定容到50 mL，4℃放置備用，使用時(shí)稀釋到所需濃度。

1.3 蛋白的表達(dá)和純化

在八肋游仆蟲(chóng)中心蛋白N端半分子N-EoCen質(zhì)粒的基礎(chǔ)上用突變?cè)噭┖蠺aKaRa MutanBEST Kit D401通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)得到了重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-N-D73K。利用PCR技術(shù)，在全分子突變體D37K的基礎(chǔ)上得到了N端突變體N-D37K。DNA序列測(cè)定表明所得到的突變體只含有目的位點(diǎn)的突變基因，而沒(méi)有其他任何位點(diǎn)的隨機(jī)突變。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，在誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)蛋白可溶性表達(dá)。融合蛋白經(jīng)PPase酶切和GST親和層析后得到目的蛋白。同時(shí)將野生型蛋白(EoCen)和課題組之前構(gòu)建完成的片段分子蛋白(N-EoCen)誘導(dǎo)表達(dá)純化得到目的蛋白。經(jīng)SDS-PAGE分析顯示所有蛋白均不含雜蛋白條帶，達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需純度。

1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠包含 390 mmol·L-1Tris(pH 8.8),10%過(guò)硫酸銨，15%acrylamide/bis(29∶1)，0.05%TEMED。Tris-Glycine電泳緩沖液包含25 mmol·L-1Tris(pH 8.3)，250 mmol·L-1甘氨酸。電泳在室溫下進(jìn)行，天然膠用冰袋保護(hù)。樣品在濃縮膠部分時(shí)，電泳儀電源電壓設(shè)置為80 V，樣品進(jìn)入到分離膠后將電壓調(diào)為120 V。電泳時(shí)間約為2 h。電泳完成后膠片經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色,甲醇-冰乙酸脫色液脫色。最后經(jīng)VILBER LOURMAT凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.5 光譜測(cè)定

熒光光譜在Hitachi-850和Hitachi F-2500熒光光譜儀上測(cè)得。測(cè)定TNS的熒光時(shí)，激發(fā)波長(zhǎng)選定320 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm，從350～600 nm記錄熒光發(fā)射譜。實(shí)驗(yàn)均在室溫、10 mmol·L-1的Hepes、pH 7.4的條件下進(jìn)行。為了便于不同滴定數(shù)據(jù)的對(duì)比并消除滴定中的稀釋效應(yīng)，熒光變化用摩爾熒光強(qiáng)度Fluorescence/cprotein來(lái)表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 變性膠電泳和天然膠電泳分析

N-D37K和N-D73K突變蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中 [圖2A(泳道1和2)]與野生型NEoCen[圖2A(泳道4)]有相同的遷移速率，所以在N端首個(gè)氨基酸突變后，分子量沒(méi)有大的改變，依然是10 kDa。與變性膠不同的是，N-EoCen[圖2B(泳道2)]比 N-D73K 和 N-D37K[圖 2B(泳道 1和 3)]更接近膠片的底部(在電泳體系中對(duì)應(yīng)正極)，表明N-D37K和N-D73K比N-EoCen擁有更多的正電荷，由于天冬氨酸帶負(fù)電，而賴(lài)氨酸帶正電，這就證明得到了純度較高的N-D37K和N-D73K突變蛋白。

圖2 (A)15%變性膠分析，(1)N-D37K；(2)N-D73K；(3)EoCen；(4)N-EoCen；(5)Marker；(B)15%天然膠分析，(1)N-D73K；(2)N-EoCen；(3)N-D37KFig.2 (A)Purified N-D37K(1),N-D73K(2),EoCen(3),N-EoCen(4),Marker(5)monitored by 15%SDS-PAGE;(B)Purified N-D73K(1),N-EoCen(2),N-D37K(3)monitored by 15%native PAGE

2.2 中心蛋白的Tb3+熒光敏化

Tb3+是被廣泛應(yīng)用的Ca2+結(jié)合蛋白的離子探針[20]。將Tb3+加入到蛋白溶液中，當(dāng)酪氨酸或色氨酸在280 nm處激發(fā)時(shí)，在545 nm處可以檢測(cè)到Tb3+的敏化熒光。圖3是Tb3+在545 nm處的摩爾敏化熒光強(qiáng)度對(duì)r，即cTb3+/cprotein，所作的滴定曲線(xiàn)。從圖3中可以看到，對(duì)于N-EoCen和N-D73K，隨著前2個(gè)Tb3+的加入，其摩爾敏化熒光強(qiáng)度都得到增強(qiáng)，并且都在r=2時(shí)增強(qiáng)減弱，說(shuō)明每個(gè)N-EoCen和ND73K都結(jié)合2個(gè)Tb3+離子，只是N-D73K的最大摩爾敏化熒光強(qiáng)度比N-EoCen降低了大約20%，而N-D37K的摩爾敏化熒光強(qiáng)度在r=1時(shí)增強(qiáng)減弱，說(shuō)明每個(gè)N-D37K只結(jié)合1個(gè)Tb3+，且其最大摩爾敏化熒光強(qiáng)度大約只有N-EoCen的25%。這些結(jié)果表明當(dāng)中心蛋白N端loopⅠ區(qū)的37位天冬氨酸突變?yōu)橘?lài)氨酸后，中心蛋白loopⅠ區(qū)喪失了金屬離子結(jié)合能力。

圖3 Tb3+分別滴定 N-EoCen(a)，N-D73K(b)和 N-D37K(c)蛋白的滴定曲線(xiàn)Fig.3 Titration curves for the addition of Tb3+to N-EoCen(a),N-D73K(b)and N-D37K(c),respectively

從八肋游仆蟲(chóng)中心蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)可見(jiàn)，N端loopⅠ區(qū)37位天冬氨酸突變?yōu)橘?lài)氨酸后，loopⅠ區(qū)的凈電荷由-1變?yōu)?1，而金屬離子帶正電，由于排斥作用，導(dǎo)致LoopⅠ喪失了金屬離子結(jié)合能力。loopⅡ區(qū)73位的天冬氨酸突變?yōu)橘?lài)氨酸后，loopⅡ區(qū)的凈電荷由-3變?yōu)?1，仍能結(jié)合金屬離子，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。N-D73K的敏化熒光強(qiáng)度相對(duì)于野生型N-EoCen有所降低，這可能是由于73位的天冬氨酸突變?yōu)橘?lài)氨酸后，Tb2-N-D73K與Tb2-NEoCen的三級(jí)結(jié)構(gòu)不同所致。

2.3 Tb3+/Ca2+與N-D37K結(jié)合常數(shù)的計(jì)算

從N-D37K的Tb3+熒光滴定曲線(xiàn) (圖3c)可以得知：一個(gè)N-D37K結(jié)合一個(gè)Tb3+，即n=1，用ct,Tb3+/cb,Tb3+對(duì)1/(nct,N-D37K-cb,Tb3+)作圖(圖 4)，按照(1)式[21]擬合。

其中ct,Tb3+，cb,Tb3+分別是鋱離子的總濃度和結(jié)合濃度，ct,N-D37K是N-D37K的總濃度。由圖4可得Tb3+與 loop Ⅱ的結(jié)合常數(shù)，KⅡ=(8.31±0.18)×104L·mol-1。

圖4 ct,Tb3+/cb,Tb3+對(duì)1/(ct,N-D37K-cb,Tb3+)作圖Fig.4 Plot of ct,Tb3+/cb,Tb3+versus 1/(ct,N-D37K-cb,Tb3+)

在Tb-N-D37K體系中，Ca2+的加入能使545 nm處鋱離子的敏化熒光猝滅。圖5是Ca2+滴定Tb-ND37K體系的熒光猝滅曲線(xiàn)，這種熒光猝滅來(lái)自于Ca2+和Tb3+與蛋白的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，即蛋白體系從ND37K-Tb轉(zhuǎn)化為N-D37K-Ca。鈣離子與N-D37K的loopⅡ的結(jié)合常數(shù)可以通過(guò)圖5和(2)式[21]擬合得到。

圖5 Ca2+滴定N-D37K-Tb的熒光競(jìng)爭(zhēng)曲線(xiàn)Fig.5 Fluorescence quenching curve for the addition of Ca2+to N-D37K-Tb

所得Ca2+與N-D37K的loopⅡ的結(jié)合常數(shù)為KⅡ=(0.94±0.12)×102L·mol-1。

Tb3+和Ca2+與中心蛋白loopⅠ、loopⅡ的平均結(jié)合常數(shù)分別為 KⅠ,Ⅱ(Tb3+)=(2.13±0.10)×105L·mol-1和 KⅠ,Ⅱ(Ca2+)=(7.52±0.02)×102L·mol-1[21]，分別大約是N-D37K 的 loop Ⅱ結(jié)合常數(shù) KⅡ(Tb3+)=(8.31±0.18)×104L·mol-1和 KⅡ(Ca2+)=(0.94±0.12)×102L·mol-1的 3倍和8倍?？梢酝茢郥b3+和Ca2+與中心蛋白loopⅠ的結(jié)合能力比loopⅡ大，中心蛋白N端半分子的2個(gè)金屬結(jié)合部位結(jié)合能力順序?yàn)棰瘢劲?。這與Ye等[22]提出的charge-ligand-balanced模型是一致的。

2.4 金屬離子誘導(dǎo)的蛋白構(gòu)象變化

遠(yuǎn)紫外圓二色譜可用于研究蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。圖6是N-EoCen，N-D73K和N-D37K在生理?xiàng)l件下的圓二色譜。可見(jiàn)突變體N-D73K、N-D37K的CD譜與N-EoCen幾乎完全重合，表明loop區(qū)天冬氨酸的突變沒(méi)有引起蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生大的變化。

圖6 N-EoCen、N-D73K和N-D37K的圓二色(CD)光譜Fig.6 Far-UV light CD spectra of N-EoCen and mutants

TNS是一種疏水熒光探針，它在水溶液中量子產(chǎn)率低，基本不發(fā)熒光，但在非極性溶液中或者和蛋白的疏水區(qū)結(jié)合后，其量子產(chǎn)率大增，熒光大大增強(qiáng)，最大熒光峰發(fā)生藍(lán)移[23]。將TNS分別加入到apoN-EoCen、Tb3+飽和 N-EoCen 以及 Ca2+飽和 NEoCen中，測(cè)得的熒光光譜如圖7A所示?？梢?jiàn)蛋白質(zhì)使TNS的最大熒光峰由500 nm藍(lán)移到435 nm，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；Tb3+飽和蛋白的增強(qiáng)效應(yīng)遠(yuǎn)大于Ca2+飽和蛋白的效應(yīng)。表明N-EoCen結(jié)合金屬離子后暴露出疏水殘基、疏水面，即N-EoCen的三級(jí)結(jié)構(gòu)在結(jié)合金屬離子后發(fā)生了改變。

用TNS分別滴定N-EoCen，N-D73K和N-D37K的空蛋白、Tb3+飽和蛋白以及Ca2+飽和蛋白，其435 nm處最大熒光強(qiáng)度如圖7B所示。從圖中可以看出，在沒(méi)有結(jié)合金屬離子時(shí)，空蛋白使TNS 435 nm處熒光增強(qiáng)，有少部分疏水表面的暴露，而且NEoCen，N-D73K和N-D37K的暴露程度也不相同，37位和73位天冬氨酸的突變導(dǎo)致疏水表面暴露程度減小，即突變?cè)谝欢ǔ潭壬细淖兞说鞍椎娜?jí)結(jié)構(gòu)；Tb3+飽和蛋白的疏水暴露程度大于Ca2+飽和蛋白，都遠(yuǎn)大于空蛋白；結(jié)合金屬離子后，N-D37K的疏水暴露程度較N-EoCen和N-D73K都小得多。說(shuō)明Asp37突變后，loopⅠ喪失了金屬離子結(jié)合能力,從而影響了中心蛋白依賴(lài)于金屬離子的構(gòu)象變化。

圖7 (A)TNS熒光光譜：(a)只有TNS時(shí)；(b)加入apoN-EoCen 時(shí)；(c)加入 Ca2+-saturated NEoCen時(shí)；(d)加入Tb3+-saturated N-EoCen時(shí)； (B)Apo-protein，Ca2+-saturated protein 和Tb3+-saturated protein的熒光柱狀圖Fig.7 (A)Emission fluorescence spectra of TNS alone(a);in the presence of apoN-EoCen(b);Ca2+-saturated N-EoCen(c)and Tb3+-saturated NEoCen(d);(B)Plot of Fluorescence of apo-protein,Ca2+-saturated protein and Tb3+-saturated protein

3 結(jié) 論

中心蛋白發(fā)揮大部分生物功能都依賴(lài)于金屬離子，當(dāng)中心蛋白loopⅠ區(qū)37位的天冬氨酸突變?yōu)橘?lài)氨酸后，loopⅠ喪失了金屬離子結(jié)合能力，進(jìn)而影響了其依賴(lài)于金屬離子的構(gòu)象變化。說(shuō)明loopⅠ區(qū)37位的天冬氨酸在中心蛋白發(fā)揮生物功能時(shí)起著重要作用，是不可缺少的。而loopⅡ區(qū)73位的天冬氨酸突變?yōu)橘?lài)氨酸后仍保持金屬離子結(jié)合能力，依賴(lài)于金屬離子的構(gòu)象變化減小。在10 mmol·L-1Hepes、pH 7.4、20 mmol·L-1KCl條件下，中心蛋白loopⅡ與Tb3+以及Ca2+的結(jié)合常數(shù)分別為KⅡ(Tb3+)=(8.31±0.18)×104L·mol-1和KⅡ(Ca2+)=(0.94±0.12)×102L·mol-1，N 端半分子的 2 個(gè)金屬結(jié)合部位的結(jié)合能力順序?yàn)椋孩瘢劲颉?/p>

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Roles of Asp37 and Asp73 in the Loop of N-Terminal Domain of Ciliate Euplotes Octocarinatus Centrin

ZHAO BingDUAN Lian LIU Wen ZHAO Ya-Qin YANG Bin-Sheng＊
(Institute of Molecular Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

Ciliate Euplotes octocarinatus centrin (EoCen)is a member of the EF-hand superfamily of calciumbinding proteins,which often associated with the centrosomes and basal bodies.To explore the importance of Asp37 and Asp73 in the loop of N-terminal of EoCen,the mutants of N-D37K and N-D73K (D is aspartic acid,and K is lysine)were obtained by molecular biological methods.The experiments of aromatic residue-sensitized Tb3+energy transfer demonstrate that:N-D73K can bind two equivalents Tb3+,which is similar to N-EoCen(WTEoCen binds four equiv.Tb3+),and N-D37K can only bind one equivalent Tb3+.Using 2-p-toluidinylnaphthalene-6-sulfonate (TNS)as a hydrophobic probe,exposure of the hydrophobic surface upon metal binding was found to be significantly reduced for the metal ion-saturated N-D37K mutant.The results indicate that Asp37 plays an important role in the biological functions of N-terminal domain of EoCen.Meanwhile the conditional binding constants of the N-EoCen loop Ⅱ were quantitatively found to be KⅡ=(8.31±0.18)×104L·mol-1and KⅡ=(0.94±0.12)×102L·mol-1with Tb3+and Ca2+,respectively,and the order for the metal-binding affinity of the two sites in N-EoCen isⅠ＞Ⅱ.

centrin;N-terminal;Tb3+;Ca2+;TNS

O641.1；O614.341；O614.23+1

：A

：1001-4861(2011)02-0245-06

2010-09-06。收修改稿日期：2010-09-25。

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.20771068；20901048)和山西省自然科學(xué)基金(No.20901048)資助項(xiàng)目。

＊通訊聯(lián)系人。 E-mail：yangbs@sxu.edu.cn