清肝化瘀合劑中藥材的水提醇沉工藝優(yōu)化＊

孫梁燕，許永軍

(浙江省慈溪市人民醫(yī)院藥劑科，浙江 寧波 315300)

清肝化瘀合劑中藥材的水提醇沉工藝優(yōu)化＊

孫梁燕，許永軍

(浙江省慈溪市人民醫(yī)院藥劑科，浙江 寧波 315300)

目的 探討清肝化瘀合劑的水提醇沉工藝條件。方法 以芍藥苷的含量為指標(biāo)，采用高效液相色譜法測(cè)定含量，用正交試驗(yàn)方法對(duì)水提和醇沉進(jìn)行工藝優(yōu)化。結(jié)果 水提最佳工藝為A3B3C2D1，即取藥材飲片，加水10倍量，提取2次，每次2 h。醇沉最佳工藝為加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%的乙醇，沉淀靜置48 h。結(jié)論 選擇芍藥苷含量為考察指標(biāo)，能客觀反映出各工藝條件下的效果。所采用的高效液相色譜法具有操作簡(jiǎn)便、分析準(zhǔn)確、快速、干擾小等優(yōu)點(diǎn)。

清肝化瘀合劑;芍藥苷;水提醇沉;高效液相色譜法

清肝化瘀合劑的處方來(lái)源于本院肝病科主任醫(yī)師治療非酒精性脂肪性肝炎并防治肝纖維化的驗(yàn)方“清肝化瘀方”，由山楂、赤芍、白芍、絞股藍(lán)、丹參、川芎等組方，具清肝化瘀、活血理氣的作用[1－2]。處方中的赤芍、白芍具清熱涼血、柔肝、化瘀之功效，芍藥苷為兩藥的主要有效成分、且含量較高，故采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定其含量作為考察指標(biāo)。筆者依據(jù)正交試驗(yàn)及平行試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)方法[3]，對(duì)水提及醇沉除雜質(zhì)的影響因素進(jìn)行考察[4]，優(yōu)選水提醇沉工藝的最佳方案?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

HP－1100型高效液相色譜儀，包括G1322A脫氣機(jī)、G1311A四元泵、Rheodyne 7725i手動(dòng)進(jìn)樣閥、G1314A VWD紫外檢測(cè)器，Chemstation色譜工作站;TU－1810型紫外－可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司);CQF－Ⅰ－6型超聲波清洗器(上海中船重工第七二六研究所);Delta 320型pH計(jì)(Mettler公司)。芍藥苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110736－200731);乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純;處方中所有藥材均購(gòu)自浙江寶瑞醫(yī)藥有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 芍藥苷含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

色譜柱:Hypersil ODS2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈－0.8% 磷酸水溶液－水(16 ∶11 ∶73，V/V/V);流速:0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):230 nm;柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:20 μL。

2.1.2 溶液制備

精密量取本品0.25 mL，置25 mL量瓶中，加60%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，一次性濾器(0.45 μm)濾過(guò)，即得供試品溶液。取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加60%甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得對(duì)照品溶液。取空白樣品(缺赤芍、白芍)0.25 mL，同供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

測(cè)定波長(zhǎng)選擇:取芍藥苷對(duì)照品溶液，以紫外分光光度計(jì)于200～500 nm波長(zhǎng)進(jìn)行掃描。結(jié)果在230 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，參考文獻(xiàn)[5，7]，確定230 nm為本法的測(cè)定波長(zhǎng)。

系統(tǒng)適用性及空白干擾試驗(yàn):取2.1.2項(xiàng)下3種溶液，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖(圖1)。結(jié)果，在此條件下芍藥苷對(duì)照品的出峰時(shí)間為10.117 min，供試品溶液中在與芍藥苷對(duì)照品相同保留時(shí)間出峰，并與其他組分達(dá)到分離，空白無(wú)干擾。理論板數(shù)按芍藥苷計(jì)算不低于10 000。

圖1 高效液相色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:精密稱取芍藥苷適量，加60%甲醇溶解并定容，制成每1 mL含0.330 mg的對(duì)照品溶液。精密吸取上述溶液0.25，0.50，0.75，1.00，1.25 mL，置 5 mL 量瓶中，以 60%甲醇定容，配成系列溶液。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為 Y=29.979 4X－40.244 4，r=0.999 9(n=5)。結(jié)果表明芍藥苷質(zhì)量濃度在 16.5 ～82.5 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):精密配制低(39.6 mg/L)、中(49.5 mg/L)、高(59.4 mg/L)3種質(zhì)量濃度的芍藥苷對(duì)照品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件分別在1 d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得日內(nèi)精密度 RSD分別為0.78% ，0.57% ，0.65%(n=5);再同法配制上述低、中、高 3 種質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，于5 d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣，測(cè)得日間精密度 RSD分別為 1.22% ，1.43% ，1.56%(n=5)。

重現(xiàn)性試驗(yàn):精密吸取6份樣品(批號(hào)為20091108)溶液，按2.1.2項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣，計(jì)算芍藥苷的含量。結(jié)果分別為4.905，4.854，4.933，4.864，4.929，4.897 g/L，RSD=0.67%(n=6)，表明方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品(批號(hào)為20091108)溶液，分別于0，2，4，6，8 h時(shí)進(jìn)樣，記錄峰面積積分值。結(jié)果芍藥苷峰面積分別為 1 432.257 93，1 416.856 57，1 440.693 36，1 420.873 66，1 437.437 87，RSD 為 1.45%(n=5)。

加樣回收試驗(yàn):取已知含量的樣品(批號(hào)為20091115，5.477g/L)0.25 mL 共 9 份，分別加入對(duì)照品溶液(0.459 g/L)2.4，3.0，3.6 mL各3份，置50 mL量瓶中，按2.1.2項(xiàng)下方法進(jìn)行處理后進(jìn)樣，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 芍藥苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.1.4 樣品含量測(cè)定

取樣品，依法處理并分析。

2.2 水提工藝條件優(yōu)選

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì):選擇提取時(shí)間(因素A)、加水量(因素B)、提取次數(shù)(因素C)、藥材粒度(因素D)為考察因素，以芍藥苷含量為指標(biāo)，選定L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平表見表2。按設(shè)計(jì)的工藝條件，以處方比例稱取藥材，水煎煮提取，合并提取液，2 500 r/min離心20 min，濾過(guò)，濾液濃縮至含生藥量為1 g/mL。

表2 因素水平表

水提工藝影響因素:根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，測(cè)得不同條件下制備的清肝化瘀合劑中芍藥苷含量，見表3。方差分析見表4。由表3直觀分析表明，水提工藝的最佳工藝條件為A3B3C2D1，各因素影響順序?yàn)橐蛩谹＞B＞C＞D;由表4可見，因素D對(duì)水提工藝影響最小，故選擇D列作為誤差列。由表4可見，以芍藥苷含量為檢測(cè)指標(biāo)所考察的4個(gè)因素中，因素A對(duì)提取工藝的影響有顯著性差異(P＜0.05)，最終確定最佳工藝為A3B3C2D1，即取藥材飲片，加水10倍量，提取2 h，分2次提取。

2.3 醇沉條件優(yōu)選

2.3.1 平行試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了除去雜質(zhì)并最大限度的保留有效成分，減小服用劑量，在濃縮的水提液中加入適量乙醇以除去其中的淀粉、樹膠、多糖和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，選用平行試驗(yàn)對(duì)影響醇沉的主要因素乙醇濃度、靜置時(shí)間，以芍藥苷為檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行考察。按上述優(yōu)選的水提取工藝制備藥液，將其等分成6份，每份50 mL，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行醇沉，靜置后藥液抽濾，取上清液，沉淀用少量乙醇洗滌，過(guò)濾，洗液與濾液合并，減壓回收至無(wú)醇味，加水調(diào)整至含生藥量1 g/mL。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果表

2.3.2 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)篩選

將3份已制備好的藥液分別加入乙醇配制成不同的醇沉濃度，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為40%，45%，50%，靜置相同的時(shí)間后抽濾藥液，取上清液，沉淀用少量乙醇洗滌，過(guò)濾，洗液與濾液合并，減壓回收至無(wú)醇味，加水調(diào)整至含生藥量1 g/mL。結(jié)果質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為40%，45%，50%的乙醇芍藥苷轉(zhuǎn)化率分別為71.1%，76.5%，73.4%，表明乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%時(shí)轉(zhuǎn)化率最高。

2.3.3 靜置時(shí)間篩選

將3份已制備好的藥液加入乙醇配制成相同的醇沉濃度，分別靜置16，24，48 h后抽濾藥液，取上清液，沉淀用少量乙醇洗滌，過(guò)濾，洗液與濾液合并，減壓回收至無(wú)醇味，加水調(diào)整至含生藥量 1 g/mL。結(jié)果靜置 16，24，48 h后芍藥苷轉(zhuǎn)化率分別為72.5%，73.8%和75.6%，表明靜置48 h時(shí)轉(zhuǎn)化率最高。

2.4 工藝驗(yàn)證

按處方比例稱取山楂、赤芍、白芍等藥材，共3份，加水10倍量，提取2次，每次2 h;以45%乙醇沉淀，靜置48 h。中試制備3批樣品，芍藥苷含量為 4.897 ～5.477 g/L。

3 討論

清肝化瘀合劑原方湯劑服用有效[1－2]，且組方中含有水溶性活性成分，故確定了水提工藝。將優(yōu)選的工藝條件經(jīng)中試放大驗(yàn)證，與小試基本吻合，且合劑中各藥材薄層層析斑點(diǎn)與原方湯劑完全一致，芍藥苷含量是原方湯劑的5.02倍。表明該工藝不僅穩(wěn)定可行、重現(xiàn)性好，而且能保持原方湯劑中的化學(xué)成分基本不變，定量指標(biāo)芍藥苷含量按制劑濃縮倍數(shù)提高，為全面評(píng)價(jià)該合劑與原方湯劑的等效性奠定了基礎(chǔ)。

芍藥苷含量測(cè)定采用高效液相色譜法，具有操作簡(jiǎn)便、分析準(zhǔn)確、快速、干擾小等優(yōu)點(diǎn)。采用文獻(xiàn)報(bào)道的流動(dòng)相如甲醇－乙腈－水(10∶10∶80)、甲醇－異丙醇－36%醋酸－水(25∶2∶2∶71)[5]、甲醇－0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液(40 ∶65)[6]、乙腈－水(13 ∶87)[7]等流動(dòng)相作試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)芍藥苷峰形均不理想，當(dāng)選用乙腈－0.8%磷酸水溶液－水(16∶11∶73，V/V/V)為流動(dòng)相且供試品以60%甲醇為溶劑時(shí)，獲得了滿意效果。

[1]張愛軍，袁國(guó)平，孫梁燕.清肝化瘀方治療非酒精性脂肪性肝炎120 例[J].浙江中醫(yī)雜志，2009，44(5):327.

[2]張愛軍，蘆亞君，陳曉蓉.清肝化瘀方抗非酒精性脂肪肝纖維化療效觀察[J].上海中醫(yī)藥雜志，2009，43(6):33.

[3]高鴻慈，陳華庭.實(shí)用藥學(xué)計(jì)算[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2007:267.

[5]張克榮，白 麗，徐贊美，等.RP－HPLC法同時(shí)測(cè)定白芍中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量[J].藥物分析雜志，2003，23(3):222－224.

[6]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:147.

[7]張?jiān)?，?暉.降壓膠囊中芍藥苷的含量測(cè)定[J].中國(guó)藥師，2009，12(3):347.

Study on Technology of Water Extraction and Alcohol Precipitation of Chinese Medicinal Materials in Qingganhuayu Mixture

Sun Liangyan，Xu Yongjun
(Department of Pharmacy， Cixi Municipal People's Hospital， Ningbo， Zhejiang，China 315300)

Objective To optimize the technological conditions of water extraction and alcohol precipitation in Qingganhuayu Mixture.Methods The orthogonal test was adopted to optimize the technology of water extraction and alcohol precipitation.The paeoniflorin content was used as the assessment index and determined by HPLC.Results The optimum water extraction process was A3B3C2D1，i.e.，taking the medicinal materials as processed pieces，adding 10 times amount of water as extracting solvent，extracting twice and 2 h each time.The optimum alcohol precipitation process was as follows:the mass fraction was 45% ethanol，precipitating and static placing for 48 h.Conclusion The paeoniflorin content as the assessment index can reflect the effects of various technological conditions.The HPLC method has the advantages of simple operating，accurate analysis，rapidity and less interference.

Qingganhuayu Mixture;paeoniflorin;water extraction and alcohol precipitation;HPLC

TQ461;R286

A

1006－4931(2011)08－0049－03

2010－09－21)

＊浙江省慈溪市科技計(jì)劃項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào):CR200710。

孫梁燕(1969－)，女，副主任藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)工作，(電子信箱)sly321123@163.com。