姜黃素對(duì)高氧致新生鼠支氣管肺發(fā)育不良的保護(hù)作用

張 鈺，韋 紅，王小玲，張曉萍

(重慶醫(yī)科大學(xué)1.附屬兒童醫(yī)院新生兒診治中心;2.兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014)

姜黃素對(duì)高氧致新生鼠支氣管肺發(fā)育不良的保護(hù)作用

張 鈺1，韋 紅1，王小玲1，張曉萍2

(重慶醫(yī)科大學(xué)1.附屬兒童醫(yī)院新生兒診治中心;2.兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014)

目的 研究姜黃素對(duì)高氧暴露致新生鼠支氣管肺發(fā)育不良的影響，探討其作用機(jī)制。方法 給予出生6 h內(nèi)的SD大鼠持續(xù)60%氧暴露14d建立肺損傷模型，通氧的同時(shí)予姜黃素100 mg/(kg·d)灌胃。觀察肺組織病理學(xué)改變，進(jìn)行輻射狀肺泡計(jì)數(shù)(RAC)，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的 dUTP缺口標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測(cè)肺組織細(xì)胞凋亡，免疫組化和Western blot法檢測(cè)肺組織活化半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表達(dá)。結(jié)果 與空氣對(duì)照組相比，隨著氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，高氧組的大鼠出現(xiàn)肺發(fā)育停滯的典型病理表現(xiàn)：肺泡增大、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化，肺泡隔增厚。RAC明顯減少，肺組織細(xì)胞凋亡明顯增加，免疫組化和Western blot法均顯示肺組織活化Caspase-3表達(dá)明顯升高。姜黃素能改善損傷的肺病理結(jié)構(gòu)，并在干預(yù)14d后使RAC顯著增多，肺組織凋亡細(xì)胞顯著減少，干預(yù)4d后肺組織活化Caspase-3顯著降低。結(jié)論 姜黃素可減輕高氧暴露所致的BPD，可能是通過抗凋亡機(jī)制實(shí)現(xiàn)其保護(hù)作用。

高氧癥;支氣管肺發(fā)育不良;姜黃素;半胱氨酸蛋白酶類;新生大鼠

支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)是新生兒尤其是早產(chǎn)兒常見的慢性肺部疾病，迄今尚無確實(shí)有效的預(yù)防措施與治療方法。早產(chǎn)兒生后輔助性高濃度氧療是BPD發(fā)生的重要因素之一，長(zhǎng)期高氧暴露可致肺組織細(xì)胞過度凋亡［1］，導(dǎo)致肺損傷以及損傷后的異常修復(fù)，引起肺發(fā)育受阻。

姜黃素是從姜黃根莖中提取的一種酚類物質(zhì)，具有廣泛的藥理作用［2］。近年大量研究指出，在合適的劑量范圍內(nèi)姜黃素具有抗多種因素所致的細(xì)胞凋亡作用［3］。姜黃素對(duì)多種急慢性呼吸系統(tǒng)疾病如 ARDS、COPD具有保護(hù)作用［4］，但姜黃素對(duì) BPD是否有保護(hù)作用、對(duì)高濃度氧所致的細(xì)胞凋亡是否有抗凋亡效應(yīng)國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究旨在建立60%氧暴露所致的新生鼠BPD動(dòng)物模型，探討姜黃素對(duì)BPD的保護(hù)作用，并從細(xì)胞凋亡角度探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：孕15d SPF級(jí)SD大鼠20只，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(渝)2007-0001】。分籠單獨(dú)飼養(yǎng)至分娩，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 藥品與主要試劑：姜黃素(C7727，Sigma，美國(guó))。兔抗大鼠活化 caspase-3多克隆抗體(AB3623，Millipore，美國(guó));免疫組化羊抗兔二抗試劑盒(SP-9001，北京中杉金橋公司);二甲基聯(lián)苯胺(DAB)染色試劑盒(CW0119，北京康為世紀(jì)公司)。總蛋白提取試劑盒(KGP250，南京凱基公司);二辛可寧酸(BCA)蛋白定量檢測(cè)試劑盒(Pierce，美國(guó));增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)試劑盒(Pierce，美國(guó))。TUNEL分析試劑盒(Roche，德國(guó))。

1.1.3 主要儀器：便攜式數(shù)字測(cè)氧儀(CY2100，浙江建德儀器設(shè)備廠)，Olympus BX51顯微鏡，Chemi-DocXRS圖像采集系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理：按隨機(jī)數(shù)字表法將出生6 h內(nèi)體重相近的大鼠分為空氣對(duì)照組(Ⅰ組);高氧組(Ⅱ組);高氧 +溶劑對(duì)照組(Ⅲ組);高氧 +姜黃素組(Ⅳ組)，每組20只。其中Ⅲ組：通氧的同時(shí)給予0.5%羥甲基纖維素鈉溶液灌胃10 mL/(kg·d)，每日1次(qd);Ⅳ組：通氧的同時(shí)給予姜黃素的混懸液10 mL/(kg·d)，qd灌胃(混懸液配制：100 mg/kg姜黃素粉末混懸于0.5%羥甲基纖維素鈉溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配，避光保存)。

1.2.2 動(dòng)物模型的制備：參照文獻(xiàn)［5］將高氧各組新生鼠10～12只每窩連同代母鼠一起置入溫度為25～26℃，濕度60% ～65%的自制氧箱內(nèi)。以測(cè)氧儀控制氧濃度;箱內(nèi)放入鈣石灰吸收CO2，防止箱內(nèi)CO2濃度過高?？諝饨M置于同一室內(nèi)空氣中，飼養(yǎng)條件同高氧組。每天開箱1 h，新生鼠稱重，將氧箱中的母鼠與空氣對(duì)照組互換防止母鼠氧中毒，并更換飼料、水和墊料。某一組鼠死亡后，將其余組去掉相同數(shù)目的新生鼠，以保持各組鼠數(shù)目相同，防止因營(yíng)養(yǎng)因素引起的差異。

1.2.3 標(biāo)本收集與處理：通氧4、14d后分別從各組隨機(jī)抽取10只大鼠，腹腔注射 10% 水合氯醛(0.3 mL/g)麻醉。剖開胸腔，氣管插管保持肺充氣狀態(tài)，于右心尖穿刺，37℃生理鹽水灌注肺直至白色。結(jié)扎右支氣管，迅速切取右肺，液氮速凍后凍存于-80℃冰箱用于Western-blot檢測(cè);從左支氣管注入預(yù)冷的4%多聚甲醛至肺膨脹至肺尖，取左肺放入多聚甲醛固定液中固定24 h后，制作石蠟切片(厚度4 μm)，用于病理學(xué)分析和免疫組化檢測(cè)。

1.2.4 肺組織形態(tài)學(xué)觀察：每例標(biāo)本取連續(xù)的石蠟切片3張，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察各組鼠的肺組織病理學(xué)改變。每張切片隨機(jī)取不重疊的5個(gè)視野(×200)，以15個(gè)視野的相應(yīng)指標(biāo)均值作為該例標(biāo)本的RAC測(cè)定值。RAC測(cè)定參照文獻(xiàn)［6］從呼吸性細(xì)支氣管中心至最近纖維隔或胸膜引垂線，計(jì)數(shù)該垂線上的肺泡數(shù)即輻射狀肺泡計(jì)數(shù)。

1.2.5 肺組織細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)：采用TUNEL法。每例標(biāo)本取2張連續(xù)的石蠟切片，嚴(yán)格按說明書操作，以不加 TdT者為陰性對(duì)照。DAB顯色，胞核棕黃色者為陽性細(xì)胞。光鏡下(×400)每張切片隨機(jī)取5個(gè)非重疊視野，計(jì)算每個(gè)視野的凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)，AI= 陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，再計(jì)算均值。

1.2.6 活化caspase-3免疫組織化學(xué)法檢測(cè)：采用免疫組化 SP法，以 PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。DAB顯色，以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著為陽性表達(dá)。每例標(biāo)本取2張連續(xù)的石蠟切片，光鏡下(×400)每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野 ，應(yīng)用 Image-pro plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析各視野染色區(qū)域的平均吸光度值(A)，最后取10個(gè)視野的平均值作為該例標(biāo)本的A值。

1.2.7 活化 caspase-3 Western-blot檢測(cè)：按蛋白提取試劑盒說明書，提取肺組織總蛋白(每100 mg組織加入500 μL裂解液)，BCA法蛋白定量。選擇 β肌動(dòng)蛋白(β-actin)作內(nèi)參;蛋白變性后取20 μL待測(cè)蛋白按序加樣電泳;電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜。TBS液室溫封閉1 h;加入一抗(兔抗大鼠活化caspase-3多克隆抗體，1∶500)4℃孵育過夜;加入HRP標(biāo)記的二抗(山羊抗兔IgG抗體，1∶5000)室溫孵育2h。ECL化學(xué)發(fā)光后采集圖像，采用Quanty One4.62進(jìn)行圖像分析后作蛋白相對(duì)表達(dá)量分析。

2 結(jié)果

2.1 肺組織形態(tài)學(xué)改變

2.1.1 一般病理學(xué)改變：I組大鼠隨鼠齡增加肺組織發(fā)育逐漸成熟。Ⅱ、Ⅲ組大鼠氧暴露4 d后肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡增大，間隔增厚，間質(zhì)輕度充血、水腫，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);氧暴露14 d后肺泡腔擴(kuò)大、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化，間隔增厚，肺泡數(shù)量減少。IV組大鼠干預(yù)4 d后肺組織充血、水腫及炎癥程度減輕，但與I組相比肺組織結(jié)構(gòu)未見明顯改善;干預(yù)14 d后肺泡結(jié)構(gòu)紊亂情況較II、III組減輕，肺泡數(shù)量增多，肺泡腔縮小。見圖1(彩插6)。

2.1.2 輻射狀肺泡計(jì)數(shù)(RAC)：Ⅰ組隨肺發(fā)育成熟，RAC逐漸增多。Ⅱ、Ⅲ組隨暴露天數(shù)增加 RAC亦逐漸增加，但與I組相比，RAC在各時(shí)間點(diǎn)均明顯減少。與Ⅱ組、Ⅲ組相比，氧暴露加用姜黃素干預(yù)4 d后，IV組RAC無明顯變化;干預(yù)14 d后，RAC明顯增加，但仍低于 I組(P ＜0.01)。見圖2(彩插6)。

2.2 肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化

Tunel染色顯示，I組僅見少量陽性細(xì)胞，且陽性細(xì)胞多為肺間充質(zhì)細(xì)胞。與之相比，II組、III組在氧暴露4、14d后凋亡指數(shù)明顯升高，且陽性細(xì)胞主要見于肺泡、小氣道上皮細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞。與II組、III組相比，氧暴露加用姜黃素干預(yù)4d后，IV組凋亡指數(shù)無明顯變化;干預(yù)14d后，凋亡指數(shù)明顯降低，但仍高于I組(P ＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠肺組織凋亡指數(shù)(AI)和活化caspase-3免疫組化檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Apoptotic index(AI)and activated caspase-3 immunoreactivity scores( s，n=10)

表1 各組大鼠肺組織凋亡指數(shù)(AI)和活化caspase-3免疫組化檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Apoptotic index(AI)and activated caspase-3 immunoreactivity scores( s，n=10)

注：同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)比較：**P ＜0.01 vs.Ⅰ組;△P ＞0.05 vs.Ⅱ 組;▲▲P ＜0.01 vs.Ⅱ 組Note：At the same time point：**P ＜0.01 vs.groupⅠ; △P ＞0.05 vs.groupⅡ;▲▲P ＜0.01 vs.GroupⅡ.

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2.3 肺組織活化 Caspase-3蛋白表達(dá)的變化

免疫組化染色見活化caspase-3廣泛表達(dá)于肺泡、支氣管上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中，陰性對(duì)照無陽性染色。與 I組相比，氧暴露4、14 d后，Ⅱ組、Ⅲ組中其表達(dá)均明顯升高。與Ⅱ組、Ⅲ組相比，氧暴露加用姜黃素干預(yù)4、14 d后，Ⅳ組中其表達(dá)均明顯降低，但仍高于Ⅰ組(P ＜0.01)。Western blot檢測(cè)活化caspase-3的結(jié)果與免疫組化檢測(cè)結(jié)果基本一致。圖3見彩插6。

3 討論

合適的動(dòng)物模型是研究疾病發(fā)病機(jī)制和防治措施的基礎(chǔ)。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)單一高氧因素刺激即可模擬人類BPD的大多數(shù)病理改變［7］，但目前國(guó)內(nèi)外尚無統(tǒng)一的高氧濃度劃分標(biāo)準(zhǔn)，研究指出60%的氧暴露動(dòng)物模型的病理改變更符合人類新型BPD的病理特點(diǎn)［8］。大鼠的肺發(fā)育過程具有與人類相似的時(shí)序性，不同的是其肺發(fā)育的最后一個(gè)階段肺泡化期于生后3 d開始，新生鼠出生時(shí)的肺發(fā)育程度相當(dāng)于人類28周齡的胎肺，生后兩周大鼠肺泡基本發(fā)育成熟。因此，本研究予新生鼠60%的氧暴露14 d干預(yù)其肺泡化過程建立BPD動(dòng)物模型，觀察高氧暴露對(duì)肺發(fā)育的影響，探討姜黃素對(duì)BPD的保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示未成熟的大鼠肺組織暴露于高氧環(huán)境14 d后，出現(xiàn)典型的肺發(fā)育停滯的病理表現(xiàn)：肺泡增大、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化，肺泡間隔增厚。評(píng)價(jià)肺泡發(fā)育程度的重要指標(biāo)RAC在氧暴露4 d后即比空氣對(duì)照組明顯減少，隨鼠齡增加，RAC反而減少，間接證明肺泡數(shù)目減少，進(jìn)一步證實(shí)高氧暴露可致肺發(fā)育停滯。而用姜黃素干預(yù)4 d后，氧暴露組大鼠肺組織炎癥程度減輕，隨干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，肺組織病理結(jié)構(gòu)改善，肺泡腔縮小，肺泡間隔變薄，RAC明顯增多，提示姜黃素對(duì)高氧暴露所致的新生鼠肺損傷具有保護(hù)作用。

凋亡在正常肺發(fā)育過程中對(duì)肺泡形成、肺泡壁變薄以及氣體交換屏障的建立等起重要作用，但肺發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期肺組織細(xì)胞的過度凋亡可干擾正常肺發(fā)育進(jìn)程，造成損傷組織異常修復(fù)，導(dǎo)致肺纖維化。Caspase-3是凋亡發(fā)生的多條路徑的最終執(zhí)行者，它的激活直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生，該酶是否被激活可作為鑒別凋亡發(fā)生與否的重要標(biāo)志之一［9］。本研究結(jié)果顯示氧暴露組鼠肺組織上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞活化 caspase-3表達(dá)明顯升高，TUNEL陽性細(xì)胞比空氣組明顯增多，且在高氧暴露急性期(暴露4d)組織細(xì)胞凋亡更為顯著，慢性期(暴露14d)凋亡效應(yīng)仍較強(qiáng)。高氧暴露早期肺組織細(xì)胞大量凋亡可能是機(jī)體對(duì)高氧刺激的一種應(yīng)激反應(yīng)，以清除過多的損傷、壞死組織細(xì)胞，從而限制炎癥反應(yīng)，試圖使肺結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常［10］。高氧暴露14d肺組織仍有大量凋亡細(xì)胞，可能與肺損傷修復(fù)延遲，大量成纖維細(xì)胞增生有關(guān)。

給予大鼠100 mg/(kg·d)的姜黃素干預(yù)后，我們發(fā)現(xiàn)氧暴露大鼠肺組織凋亡指數(shù)明顯降低，凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3表達(dá)顯著減少，提示姜黃素可通過抗凋亡機(jī)制減輕高氧暴露所致的新生鼠肺損傷。研究證實(shí)高氧可致大量活性氧(ROS)在肺組織堆積，堆積的ROS可對(duì)細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA產(chǎn)生不可逆性損傷，ROS是細(xì)胞凋亡的重要介質(zhì)之一［1］，已有研究提示姜黃素可通過抗氧化作用清除組織細(xì)胞內(nèi)過多的ROS［11］。因此姜黃素可能通過對(duì)高氧暴露組織中ROS的清除發(fā)揮其抗高氧所致細(xì)胞凋亡的作用，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

(本文圖1～3見彩插6。)

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Curcumin attenuates bronchopulmonary dysplasia induced by hyperoxia in neonatal rats

ZHANG Yu1，WEI Hong1，WANG Xiao-ling1，ZHANG Xiao-ping2
(1.Neonatal Diagnosis and Treatment Center of Children’s Hospital;2.Key Laboratory of Developmental Diseases in Childhood，Ministry of Education，Chongqing Medical University，Chongqing 400014，China)

Objective To investigate the effect of curcumin on bronchopulmonary dysplasia induced by hyperoxia in neonatal rats and explore its potential mechanism.Methods Eighty SD newborn rats were randomly divided into 4 groups： room air group，hyperoxia group，hyperoxia+vehicle group，hyperoxia+curcumin group.Pathomorphology of the lungs was observed with hematoxylin-eosine staining.Cell apoptosis in the lung tissue was detected by TUNEL staining.The expression of activated caspase-3 was detected by immunohistochemistry and Western blotting.Results Compared with the normoxic group，rats exposed to hyperoxia showed a histological pattern of alveolar simplification characterized by the presence of larger and fewer distal air spaces.In addition，the radial alveolar counting(RAC)was significantly lower and attenuated with curcumin treatment for 14 days.Hyperoxia exposure also resulted in significant cell apoptosis，which was reduced after treatment with curcumin.Both immunohistochemistry and Western blot demonstrated an increased expression of activated caspase-3 in the lung tissue after hyperoxia exposure，which was reduced by curcumin treatment for 4 days.Conclusion Curcumin alleviates bronchopulmonary dysplasia induced by hyperoxia in neonatal rats，probably via antiapoptotic mechanisms.

Hyperoxia;Bronchopulmonary dysplasia;Curcumin;Caspase-3;Neonatal rat

Q95-3，R722

A

1005-4847(2011)02-0120-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.02.008

重慶市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：CSTC2007BB5326)。

張鈺(1985-)，女，研究方向：圍生期肺發(fā)育與肺損傷，Email：smile284521@sina.com。

韋紅，副教授，Email：waehong@sina.com.

2010-09-19