氣管內(nèi)反復(fù)滴入脂多糖法建立大鼠慢性阻塞性肺疾病模型

劉君波，黃夢珊，余晨曦，王 硯，唐法娣

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院呼吸藥物研究實驗室，浙江 杭州 310058)

氣管內(nèi)反復(fù)滴入脂多糖法建立大鼠慢性阻塞性肺疾病模型

劉君波，黃夢珊，余晨曦，王 硯，唐法娣

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院呼吸藥物研究實驗室，浙江 杭州 310058)

目的 評價脂多糖(LPS)誘發(fā)大鼠慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型的可行性。方法 氣管內(nèi)滴入脂多糖或生理鹽水，每周1次，共8周。測定大鼠的氣道阻力(RL)和肺動態(tài)順應(yīng)性(Cdyn)，計數(shù)大鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白細胞總數(shù)及分類，肺組織病理切片行HE和AB-PAS染色，并測定肺組織粘蛋白(MUC5AC)的含量。結(jié)果 模型組大鼠RL明顯升高(87.5%)，Cdyn顯著下降(16.4%);BALF中白細胞總數(shù)及分類中的中性粒細胞、淋巴細胞和單核巨噬細胞數(shù)均明顯高于對照組;光鏡下可見病變呈慢性支氣管炎及肺氣腫樣改變。結(jié)論 反復(fù)氣管內(nèi)滴入LPS可用于制備大鼠COPD模型，其肺功能、BALF細胞學(xué)及病理學(xué)改變符合人類COPD表現(xiàn)，可以用于實驗研究。

慢性阻塞性肺疾病;脂多糖;大鼠;模型

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SD大鼠40只，雌雄各半，體重(200±20)g，購于浙江大學(xué)實驗動物中心【SCXK(浙)2007-0098】。

1.1.2 藥物及試劑：LPS(Esherichia coli O111：B4，美國Sigma公司);乙酰甲膽堿(Mch，美國 Sigma公司);粘蛋白(MUC5AC)的ELISA試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技有限公司)。

1.1.3 儀器：Olympus BX51/BX52系統(tǒng)顯微鏡(日本Olympus公司);MedLab生物信號記錄分析系統(tǒng)(南京美易公司);百瑞壓縮霧化器(Pari Boy N 085，德國百瑞有限公司);Eppendorf冷凍離心機(Eppendorf)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備：SD大鼠40只，隨機分為正常對照組和慢性阻塞性肺疾病模型組。模型組大鼠乙醚麻醉后用耳鏡插入喉口，以靜脈套管針向氣管內(nèi)注入200 μg脂多糖(用生理鹽水配制成1 g/L溶液)，正常對照組氣管內(nèi)滴入等量生理鹽水(NS)，每周1次，持續(xù)8周。肺功能測定及肺組織病理學(xué)檢查分別取兩組中的不同大鼠。

1.2.2 大鼠氣道阻力(RL)和肺動態(tài)順應(yīng)性(Cdyn)測定：大鼠于第8周后用30%烏拉坦(3.3 mL/kg，i.p.)麻醉，行氣管插管，然后在大鼠前胸4-5肋間插入胸導(dǎo)管，將其仰臥位、置于密閉整體體積描記箱內(nèi)。穩(wěn)定5 min后，由MedLab生物信號記錄分析系統(tǒng)，導(dǎo)出基礎(chǔ)潮氣量(VT)、氣道流速(˙V)和跨肺壓(Ptp)，經(jīng)數(shù)據(jù)處理得出基礎(chǔ) RL和 Cdyn。分別配制濃度為 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 、16.0、32.0 mg/mL的Mch生理鹽水溶液，置于壓縮霧化器中，霧化吸入30 s，兩種吸入濃度間隔5 min。測出吸入不同濃度Mch誘導(dǎo)的大鼠VT、˙V及Ptp，由此得出RL及Cdyn的變化，并計算氣道阻力的增加值(RL%)及肺順應(yīng)性的下降值(Cdyn%)。計算公式：(RL)(cmH2O/(mL·s))=Ptp/˙V，Cdyn(mL/cm H2O)=VT/Ptp。

1.2.3 支氣管肺泡灌洗液白細胞計數(shù)和分類：做完肺功能后，股動脈放血處死大鼠，用10 mL生理鹽水進行支氣管肺泡灌洗，灌洗分2次進行，回收支氣管肺泡灌洗液(BALF)，回收率約60% ～80%。BALF 4℃，1000 r/min離心10 min，取上清液 -80℃保存，沉淀用NS 0.5 mL混勻，取細胞混懸液100 μL用白細胞計數(shù)液100 μL稀釋，計數(shù) BALF中白細胞總數(shù)，稀釋液涂片，自然干燥，用瑞氏-吉姆薩染色后作白細胞分類計數(shù)。

1.2.4 肺組織病理學(xué)檢查：大鼠股動脈放血處死后，取左肺組織經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，行 HE染色和阿爾辛藍-過碘酸雪夫染色(AB-PAS)，并測定以下指標：

(1)肺組織炎癥程度：HE染色切片中，根據(jù)炎癥和上皮脫落程度將炎癥分為“-、+、++、+++”四個等級。“-”即未見明顯炎癥細胞浸潤;“+”即主支氣管周圍有不等量的炎癥細胞浸潤(炎癥細胞以淋巴細胞、中性粒細胞為主，也有少量的單核細胞及嗜酸性粒細胞)，各級細支氣管周圍有少量或無炎癥細胞浸潤，支氣管腔內(nèi)無膿細胞，支氣管結(jié)構(gòu)完整;“+++”即主支氣管及各級細支氣管周圍均有大量淋巴細胞、中性粒細胞浸潤，也有不等量的單核細胞及嗜酸性粒細胞浸潤，部分細支氣管腔內(nèi)充滿膿細胞，并可出現(xiàn)管壁破壞及(或)上皮脫落;“++”介于“+”和“+++”之間。

(2)肺氣腫程度：肺泡壁變薄，肺泡擴張，部分融合成小囊狀，根據(jù)肺氣腫的范圍分為“-、+、++、+++”四個等級?！?”即無肺氣腫病變;“+”即肺組織胸膜臟層下可見少量肺泡氣腫;“+++”即肺氣腫病變占整個切面的2/3以上;“++”介于“+”和“+++”之間。

(3)肺平均內(nèi)襯間隔(Lm)：計數(shù)通過顯微鏡視野中央“十”字交叉線的肺間隔數(shù)(NS)。測出十字線的總長度(L)，以L/NS即得Lm，其數(shù)值反映肺泡平均直徑。測量時避開支氣管及血管。每張切片測8個視野，求平均值。

(4)平均肺泡數(shù)(MAN)：計數(shù)每個視野內(nèi)的肺泡數(shù)，除此視野的面積，即得 MAN，其數(shù)值反應(yīng)肺泡密度。測量時避開支氣管及血管。每張切片測8個視野，求平均值。

(5)杯狀細胞比值：AB-PAS染色切片中，杯狀細胞以AB染色為主，少數(shù)杯狀細胞呈PAS著色或是AB/PAS混合著色，因此觀察以AB著色為杯狀細胞計數(shù)指標，每張切片計數(shù)1支支氣管和3～5支細支氣管陽性杯狀細胞數(shù)和柱狀上皮細胞總數(shù)，計算陽性杯狀細胞數(shù)/柱狀上皮細胞總數(shù)比值，即杯狀細胞陽性百分率，求平均值。

1.2.5 肺組織粘蛋白(MUC5AC)含量測定：用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0 for Windows進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以s表示，采用兩組間均數(shù)t檢驗，等級資料采用RADIT分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺功能的測定

兩組大鼠基線及不同濃度Mch氣霧吸入后的RL及Cdyn的實測值見圖 1、圖2，經(jīng)計算 RL增加百分率及Cdyn下降百分率見圖3，大鼠的基礎(chǔ)RL值較對照組增加了 87.5%，并且基礎(chǔ) Cdyn值下降了16.40%，均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，說明在模型組氣流受限使RL值增加和 Cdyn值下降;在 Mch≤1 mg/mL刺激下，模型組 RL均明顯高于對照組(P＜0.05);Mch 濃度為 2、4、16、32 mg/mL 時，對照組 RL增加百分率和Cdyn下降百分率均顯著高于模型組，說明模型組對Mch氣霧刺激呈低反應(yīng)。

2.2 BALF中白細胞總數(shù)和分類計數(shù)

模型組BALF中白細胞總數(shù)、中性粒細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)和單核巨噬細胞數(shù)均較對照組明顯增多(表1)。

2.3 肺組織病理學(xué)改變

2.3.1 肺組織炎癥： 光鏡下可見對照組支氣管周圍及間質(zhì)無炎癥細胞浸潤(圖4A，彩插7)。模型組大鼠可見不同程度的慢性支氣管炎及肺間質(zhì)炎，炎癥細胞明顯浸潤，炎癥以支氣管周圍及血管周圍為主，炎癥細胞以淋巴細胞為主，也有較多的單核細胞及漿細胞存在，氣管腔內(nèi)以中性粒細胞為主(表2圖4B見彩插7)。

圖1 基線及各Mch濃度刺激下的RL值Fig.1 The lung resistance(RL)in rats after methacholine inhalation.

圖2 基線及各Mch濃度刺激下的Cdyn值Fig.2 The lung dynamic compliance(Cdyn)in rats after methacholine inhalation.

圖3 不同Mch濃度刺激下的大鼠氣道反應(yīng)Fig.3 The airway responsiveness induced by methacholine inhalation.

2.3.2 肺氣腫樣改變：光鏡下可見正常組肺泡未見擴張，結(jié)構(gòu)正常(圖5A見彩插7);模型組肺泡大小不等，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡管、肺泡囊和肺泡明顯擴張，肺泡壁變薄，并有不同程度的撕裂，融合成肺大泡，與正常組比較，Lm明顯增大，MAN明顯減少(圖 5B見彩插 7，表 3，表4)。

2.3.3 支氣管杯狀細胞增生及肺組織粘蛋白含量：模型組與正常組比較，支氣管、細支氣管杯狀細胞明顯增生(圖6A、6B，彩插7)，杯狀細胞陽性百分率顯著增高;肺組織 MUC5AC的含量也明顯增高(表5)。

表1 對照組與模型組大鼠BALF中白細胞總數(shù)及分類計數(shù)的比較 ( s，n=10)Tab.1 Total and differential white blood cell counts in BALF of the rats.(s，n=10)

表1 對照組與模型組大鼠BALF中白細胞總數(shù)及分類計數(shù)的比較 ( s，n=10)Tab.1 Total and differential white blood cell counts in BALF of the rats.(s，n=10)

注：與對照組比較，**P ＜0.01，***P ＜0.001Note： vs.control group，**P ＜0.01，***P ＜0.001

?

表2 對照組與模型組大鼠肺組織炎癥 (n=10)Tab.2 Inflammation of the rat lung tissues(n=10)

表3 對照組與模型組大鼠肺氣腫改變(n=10)Tab.3 Emphysematous changes in the rats(n=10)

表4 對照組與模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)改變(s，n=10)Tab.4 Alveolar changes in the rats(s，n=10)

表4 對照組與模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)改變(s，n=10)Tab.4 Alveolar changes in the rats(s，n=10)

注：與對照組比較，***P＜0.001Note： vs.control group，***P ＜0.001

?

表5 大鼠支氣管陽性杯狀細胞增生及粘蛋白含量(± s，n=10)Tab.5 Airway goblet cell proliferation and MUC5AC content in the rats(s，n=10)

表5 大鼠支氣管陽性杯狀細胞增生及粘蛋白含量(± s，n=10)Tab.5 Airway goblet cell proliferation and MUC5AC content in the rats(s，n=10)

注：與對照組比較，*P ＜0.05，***P ＜0.001Note： vs.control group，*P ＜0.05，***P ＜0.001

?

3 討論

COPD是具有氣流阻塞特征的慢性支氣管炎和(或)肺氣腫，氣流阻塞呈進行性發(fā)展，但部分有可逆性，可伴有氣道高反應(yīng)性。符合臨床實際的理想的COPD動物模型應(yīng)具有與人類疾病相一致的以氣流受限為特征的肺功能改變，同時還伴有肺內(nèi)中性粒細胞占優(yōu)勢的炎癥反應(yīng)和氣道、肺實質(zhì)及肺血管的損傷。應(yīng)具備如下標準：①致傷因素與臨床COPD常見誘因基本一致;②必須有氣流阻塞存在，小氣道阻力增高、肺動態(tài)順應(yīng)性下降;③氣道重塑(建);④可伴有氣道高反應(yīng)性。

脂多糖存在于革蘭陰性菌的細胞外壁，主要由類脂質(zhì)和多糖構(gòu)成，在環(huán)境中普遍存在。研究表明，COPD并非全部由吸煙引起的，其他一些環(huán)境暴露或職業(yè)性暴露也是COPD的重要致病因素，而這些環(huán)境或職業(yè)性暴露如有機粉塵等的活性成分就是內(nèi)毒素。研究表明，LPS能促進很多導(dǎo)致肺氣腫改變的病理學(xué)機制，如氧化應(yīng)激，蛋白酶與抗蛋白酶失衡及凋亡等。文獻報道人長期暴露于含有LPS的有機粉塵可以導(dǎo)致類似于COPD的臨床表現(xiàn)，動物實驗也表明LPS的慢性暴露可以導(dǎo)致與COPD和肺氣腫相同的病理生理學(xué)改變［8］，形成伴有慢性炎癥反應(yīng)的不可逆的肺泡擴大［5，6］。

動物肺功能的測定對確定模型是否出現(xiàn)氣流受限具有重要的意義。本實驗中我們通過測定大鼠基線及不同Mch濃度刺激下的RL及Cdyn值后發(fā)現(xiàn)，大鼠的基礎(chǔ)RL值較對照組增高87.5%，基礎(chǔ)Cdyn值下降16.4%，均有統(tǒng)計學(xué)差異，說明存在氣流阻塞。但是，通過計算不同 Mch濃度刺激下的 RL增加百分率和 Cdyn降低百分率我們可以發(fā)現(xiàn)，模型組對Mch氣霧刺激的反應(yīng)不如對照組明顯。已有文獻報道［12-14］，對于存在氣道黏液高分泌的大動物(狗，羊)，比較氣霧和血管注入兩種方式給予Mch刺激后發(fā)現(xiàn)，動物對氣霧給予的Mch刺激反應(yīng)低下，而對血管注入的Mch刺激氣道反應(yīng)明顯增高，推測可能是由于氣道黏液過度分泌導(dǎo)致氣道黏膜滲透性降低從而使通過氣霧給予Mch刺激所測得的氣道反應(yīng)低于其真實值。因此，本實驗測得的大鼠對氣霧給予的Mch刺激的反應(yīng)低下與大動物對氣霧給予的Mch刺激反應(yīng)低下是一致的。

本研究采用反復(fù)氣道內(nèi)滴入 LPS誘發(fā)大鼠氣管支氣管的慢性炎癥及肺實質(zhì)的損傷，以期建立大鼠COPD模型。實驗結(jié)果表明，模型組不僅出現(xiàn)了COPD典型的病理學(xué)改變，如肺內(nèi)炎癥細胞的浸潤，杯狀細胞化生，氣道壁的增厚及肺泡腔的擴大，還出現(xiàn)了肺功能的改變，如 RL的明顯增大，Cdyn的顯著下降，表明存在氣流阻塞。本模型制作簡便經(jīng)濟，可以用于COPD實驗研究。

(本文圖4～6見彩插7。)

［1］ Blanc PD，Iribarren C，Trupin L，et al.Occupational exposures and the risk of COPD： dusty trades revisited［J］.Thorax，2009，64：6-12.

［2］ Matheson MC，Benke G，Raven J，et al.Biological dust exposure in the workplace is a risk factor for chronic obstructive pulmonary disease［J］.Thorax，2005，60：645-651.

［3］ Spaan S，Wouters IM，Oosting I，et al.Exposure to inhalable dust and endotoxins in agricultural industries［J］. Environ Monit，2006，8：63-72.

［4 ］ Khan AJ，Nanchal R.Cotton dust lung diseases［J］.Curr Opin Pulm Med，2007，13：137-141.

［5］ Stolk J，Rudolphus A，Davies P，et al.Induction of emphysema and bronchial mucus cell hyperplasia by intratracheal instillation of lipopolysaccharide in the hamster［J］.J Pathol，1992，167：349-356.

［6］ Vernooy JH，Dentener MA，van Suylen RJ，et al.Long-term intratracheal lipopolysaccharide exposure in mice results in chronic lung inflammation and persistent pathology［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2002，26：152-159.

［7］ 馬楠，崔德健，梁研杰，等.氣管內(nèi)注入脂多糖法建立大鼠慢性支氣管炎模型［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，1999，22(6)：371-372.

［8］ Brass DM，Hollingsworth JW，Cinque M，et al.Chronic LPS inhalation causes emphysema-like changes in mouse lung that are associated with apoptosis［J］.Am J Resp Cell Mol Biol，2008，39：584-590.

［9］ King M，Kelly S and Cosio M.Alteration of airway reactivity by mucus.Resp Physiol，1985，62(1)：47-59.

［10］ De Sanctis GT，Kelly SM，Saetta MP，et al.Hyporesponsiveness to aerosolized but not to infused methacholine in cigarette-smoking dogs［J］.Am J Respir Crit Care Med，1994，149(6)：1740.

Establishment of a rat model of chronic obstructive pulmonary disease by intratracheal instillation of lipopolysaccharide

LIU Jun-bo，HUANG Meng-shan，YU Chen-xi，WANG Yan，TANG Fa-di
(Zhejiang Research Laboratory of Respiratory Drugs，College of Medicine，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China)

Objective To establish and evaluate the feasibility of a rat model of chronic obstructive pulmonary disease(COPD)induced by intratracheal instillation of lipopolysaccharide(LPS).Methods LPS or saline was instilled intratracheally in rats once a week for consecutive 8 weeks.The rats were anesthetized and taken for the measurement of lung resistance(RL)and dynamic compliance(Cdyn).Total and differential white blood cell counts in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were carried out.The pathological changes of the lung tissues were observed using HE and AB-PAS staining，and the mucin 5AC content was measured.Results Intratracheal instillation of LPS caused a significant increase in RL(87.5%)and decrease in Cdyn(16.4%).Total and differential white blood cell counts in BALF such as neutrophils，lymphocytes and macrophages were higher in the LPS-treated rats.Chronic bronchitis and emphysematous changes were observed as well.Conclusion A typical rat model of COPD can be induced by repeated intratracheal instillation of LPS，showing many features of human COPD in the lung function，BALF cytologic and pathologic changes.

Chronic obstructive pulmonary disease;Lipopolysaccharide;Rat;Model

Q95-33

A

1005-4847(2011)02-0129-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.02.010

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是嚴重危害人類健康的一組常見病，病死率和致殘率均較高，其防治研究早已受到國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注。眾所周知，吸煙是 COPD最主要的致病因素，現(xiàn)有的COPD動物模型也多是通過被動吸煙所建立的，但是越來越多的研究表明，某些職業(yè)性暴露(如有機粉塵等)也是COPD形成的重要原因［1，2］，而這些職業(yè)性暴露的活性成分就是細菌內(nèi)毒素［3，4］。慢性支氣管炎是由于感染或非感染因素引起氣管、支氣管黏膜及其周圍組織的慢性非特異性炎癥，以慢性支氣管炎或肺氣腫和氣流阻塞為特征的COPD是老年常見呼吸系統(tǒng)疾病。鑒于脂多糖(LPS)的環(huán)境或職業(yè)性暴露與支氣管的慢性非特異性炎癥及COPD的形成與發(fā)展有關(guān)，我們考慮通過反復(fù)氣道內(nèi)滴入LPS的方法摸索建立大鼠 COPD 模型［5-7］。

浙江省中醫(yī)藥重點項目研究計劃資助項目(2008ZA014)。

劉君波，女，在讀碩士研究生。

唐法娣，Email： fadit@zju.edu.cn，Tel：13656667396

2010-07-20