攜帶人類GAD67基因真核表達載體的構建及轉染骨髓基質細胞*

謝三平,陳吉相,李慧,徐婧,黃園園

1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內科,武漢 430022;2.荊州市中心醫(yī)院神經(jīng)內科,湖北荊州 434020

攜帶人類GAD67基因真核表達載體的構建及轉染骨髓基質細胞*

謝三平1,2,陳吉相1#,李慧1,徐婧1,黃園園1

1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內科,武漢 430022;2.荊州市中心醫(yī)院神經(jīng)內科,湖北荊州 434020

目的:構建攜帶人類谷氨酸脫羧酶67(GAD67)基因的真核表達載體pDC316-CMVEGFP-GAD67,并轉染大鼠骨髓基質細胞(BMSCs)。方法:利用基因重組技術,構建 pDC316-CMV-EGFP-GAD67真核表達載體;利用脂質體將其轉染通過貼壁方法分離培養(yǎng)出來的BMSCs,熒光顯微鏡下觀察并經(jīng)流式細胞儀檢測其轉染效率,免疫組化檢測GAD67蛋白在BMSCs中的表達。結果:成功構建pDC316-CMV-EGFP-GAD67真核表達載體,轉染BMSCs后熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光細胞,流式細胞儀檢測轉染后48 h的轉染效率為37.3%,免疫組化檢測轉染后48 h,BMSCs內GAD67蛋白呈陽性表達。結論:構建pDC316-CMV-EGFP-GAD67真核表達載體并成功轉染BMSCs。

谷氨酸脫羧酶67;真核表達載體;轉染;骨髓基質細胞

#【通訊作者】陳吉相,Tel:86-27-85726203,E-mail:cz283895@yahoo.cn

研究顯示,癲癇的發(fā)生與神經(jīng)元退行性變性引起的腦內興奮性遞質與抑制性遞質系統(tǒng)功能失衡有密切聯(lián)系。谷氨酸(glutam inic acid,GLU)和γ-氨基丁酸(gamma-am inobutyric acid,GABA)是調節(jié)腦內興奮性與抑制性平衡最重要的2種遞質,谷氨酸脫羧酶(g lu tamic acid decarboxylase,GAD)催化GLU脫羧反應生成GABA。GAD有GAD65和GAD67兩種亞型,其中GAD67在調節(jié)GABA的生成和釋放中起主要作用[1]。利用攜帶及表達GAD67基因的神經(jīng)干細胞腦內移植治療癲癇可能具有重要價值[2]。骨髓基質細胞(bonemarrow stromal cells,BMSCs)是骨髓內造血干細胞以外的非造血干細胞,屬于多能干細胞[3],在特定條件下,可以分化為成骨細胞、脂肪細胞、骨骼肌細胞、肝細胞、心肌細胞等[4-8],還能分化為神經(jīng)前體細胞[9,13],具有神經(jīng)細胞分化潛能,被作為種子細胞廣泛應用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療研究中。本研究利用基因重組技術,通過酶切、連接重組方法構建攜帶人類GAD67基因片段的真核表達載體 pDC316-CMV-EGFPGAD67后,借助轉基因技術,利用脂質體介導將其轉染入BMSCs,觀察其轉染效果及轉染后目的基因的表達,為進一步研究基因修飾后的BMSCs移植治療癲癇提供前提條件。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動物:雌性SD大鼠,體質量為(150±15)g,由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供。②主要試劑與材料:NotI、SpeI及 T4連接酶(購于 NEB公司);Easy Taq DNA聚合酶、dNTPs(購于北京全式金生物技術有限公司);小牛腸堿性磷酸酶(calf intestinal alkaline phosphatase,CIAP)(購于 Prom ega公司);PCR引物、LipofectamineTM2000(購于 Invitrogen公司);DNA凝膠回收與純化試劑盒(購于北京博邁德科技發(fā)展有限公司);無內毒素高純質粒小量快速提取試劑盒(購于北京百泰克生物技術有限公司);DNA Marker(購于諾維森生物科技有限公司);DMEM/F12培養(yǎng)基(購于Hyclone公司);胎牛血清(購于杭州四季青生物工程有限公司);胰蛋白酶(購于Ameresco公司);G418(購于Calbiochem公司);兔抗人GAD67多克隆抗體、生物素標記的羊抗兔IgG抗體、SP免疫組化試劑盒、DAB底物顯色試劑盒(購于武漢博士德生物工程有限公司)。③質粒和菌株:感受態(tài)DH 5α(購于北京全式金生物技術有限公司);真核表達載體 pDC316-cm v-EGFP和 pCM V6-XL5-GAD67質粒[毅新興業(yè)(北京)科技有限公司提供]。

1.2 方法

1.2.1 真核表達載體pDC316-CMV-EGFPGAD67的構建及鑒定 由毅新興業(yè)(北京)科技有限公司完成。

1.2.2 BMSCs的分離、培養(yǎng) 取SD大鼠1只,10%水合氯醛0.3m L/100g體質量腹腔注射麻醉,75%的乙醇浸泡5min,無菌條件下分離雙側股骨、脛骨,沿骨骺線剪去兩端,無菌注射器抽取6 m L培養(yǎng)液(含20%胎牛血清的DM EM/F12)沖出骨髓液,反復吹打制成細胞懸液,200 mm濾網(wǎng)過濾,收集細胞懸液,4℃離心6min,去掉上清,加入新培養(yǎng)液吹打成單細胞懸液后接種于50 m L培養(yǎng)瓶中,放入 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d后首次換液,去掉未貼壁細胞,繼續(xù)培養(yǎng);4 d后再次換液。第9天時細胞生長融合達90%左右,用0.25%的胰蛋白酶室溫下消化約60 s,鏡下觀察貼壁細胞突起收縮,細胞變圓開始漂浮時倒掉消化液,加入含血清的培養(yǎng)液終止消化,吸管吹打并混勻成單細胞懸液,分裝入2個50 m L培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng),以后傳代1次/周,中途換液1次。

1.2.3 pDC316-CMV-EGFP-GAD67載體轉染BMSCs 取第3代BMSCs,按1×106個/孔接種于24孔板中,第2天鏡下觀察細胞融合度達85%左右即進行轉染,轉染參照LipfectamineTM2000說明書進行,每孔加質粒DNA 1 μg,Lip fectamineTM2000 2 μL,無血清培養(yǎng)基室溫下孵育后轉染,6 h后更換含血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。同時設空白對照組(僅加等量質粒DNA),空質粒轉染組(僅加等量 LipfectamineTM2000)、完全空白組。并于轉染24 h后加入G418(400μg/m L)加壓篩選。

1.2.4 pDC316-CMV-EGFP-GAD67載體轉染BMSCs檢測 分別于轉染后24、48及72 h在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白在BMSCs中的表達;轉染后48 h,選取5張片子,每張片子隨機取10個高倍視野,每個視野計數(shù)100個細胞,陽性細胞百分比=陽性細胞數(shù)/(陽性細胞數(shù) +陰性細胞數(shù))×100%;并于48 h后消化轉染的BMSCs,滴管吹打成單細胞懸液,取1.5 m L的細胞懸液流式細胞儀檢測轉染率。

1.2.5 轉染后GAD67蛋白在BMSCs中的表達 轉染48 h后消化BMSCs,吹打成單細胞懸液,接種于蓋玻片上培養(yǎng),次日細胞貼壁后棄去培養(yǎng)基,PBS溶液沖洗2遍,4%多聚甲醛固定20min后棄掉固定液,PBS溶液洗2遍;加入一抗(兔抗人GAD67多克隆抗體,1∶100稀釋),4℃濕盒過夜,再37℃孵育1 h,PBS沖洗,5min/次,共3次;加二抗(生物素標記的羊抗兔IgG,1∶100稀釋),37℃濕盒孵育1 h,PBS沖洗,5min/次,共3次;按SP免疫組化試劑盒說明進行,DAB顯色。同時設空白對照和未加一抗的陰性對照。普通光鏡下觀察并拍照。

2 結果

2.1 pDC316-CM V-EGFP-GAD67的構建及鑒定 構建 pDC316-CMV-EGFP-GAD67真核表達載體后通過PCR引物鑒定正反,并電泳檢測,見圖1A;挑選出陽性克隆行雙酶切驗證,可切出雙條帶,見圖1B;對經(jīng)過酶切結果呈陽性的質粒進行測序,分別對其5'-端進行正向測序和3'-端進行反向測序,將測序結果與NCBI上的NM_000817分別進行比對,結果顯示插入pDC316-CM V-EGFP-GAD67真核表達載體中的GAD1cDNA序列正確,全長3.5 kbp。

2.2 BMSCs的體外培養(yǎng)及觀察 倒置顯微鏡下觀察,初種細胞呈圓形,散在懸浮于培養(yǎng)液中;72 h后首次換液時,顯微鏡下觀察可見部分細胞貼壁生長,呈圓形、梭形或不規(guī)則形,見圖2A;傳代后的細胞生長形態(tài)較均一,折光性強,呈紡錘狀,長突起延伸于兩端,漩渦狀、網(wǎng)狀、輻射狀排列,見圖2B。

2.3 轉染結果及轉染效率 轉染24 h后熒光顯微鏡下觀察,PDC316-CMV-EGFP空質粒轉染孔及 pDC316-CMV-EGFP-GAD67轉染孔均可見綠色熒光,見圖2C、2D;72 h時發(fā)綠色熒光細胞增加,熒光亮度增強,見圖2E;空白對照孔中無綠色熒光,見圖2F;轉染后48 h,GAD67陽性細胞百分比為(15.6±4.15)%;48 h后流式細胞儀檢測pDC316-CM V-EGFP-GAD67轉染BMSCs效率為37.3%,見圖2G。

2.4 轉染后BMSCs中GAD67蛋白的表達

免疫組織化學檢測顯示,轉染48 h后的BMSCs內GAD67蛋白呈陽性表達,見圖2H,空質粒轉染組及空白對照組均未見陽性表達,見圖 2I、2J。

3 討論

目前認為癲癇發(fā)病的最終環(huán)節(jié)與腦內興奮性及抑制性遞質功能失衡有關。GAD是調節(jié)GLU與GABA生成平衡的關鍵酶,GAD功能下調將會導致GABA遞質功能相對或絕對不足,造成興奮性與抑制性神經(jīng)功能的失調[10,11]。GAD功能下調可能與GABA能為主的抑制性中間神經(jīng)元(GAD陽性神經(jīng)元)的減少有關[12]。增強癲癇患者致癇灶中的GABA能細胞的作用或移植GABA能神經(jīng)元到癲癇患者致癇灶中以補充其不足,可能對癲癇、尤其對難治性癲癇起到意想不到的治療效果。

圖1 A-B A:菌落PCR結果,1、3孔道內的克隆為陽性克隆,5孔道為DNA Marker(上至下依次為2000,1000,750,500,250,100 bp);B:酶切鑒定結果,1孔道為酶切產(chǎn)物,其中A為pDC316-CMV-EGFP質粒,B為GAD67片段,2孔道為酶切前的質粒,3孔道為DNA Marker

圖2 A-J 原代培養(yǎng)72 h(A)及傳代后(B)的 BMSCs形態(tài)(倒置顯微鏡,×200);空質粒轉染(C)、轉染后24 h(D)、72 h(E)、未轉染(F)BMSCs熒光顯微鏡下細胞形態(tài)(熒光顯微鏡,×200)及流式細胞儀檢測結果(G);轉染48 h后(H)、空質粒轉染(I)及空白對照組(J)的BMSCs內GAD67蛋白免疫組化染色結果(光學顯微鏡,×100)

BMSCs是廣泛應用于神經(jīng)科學領域研究中非胚源性多能干細胞,Wislet-Gendebien等[9]將BMSCs與小腦顆粒細胞共同培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)成體BMSCs能表達神經(jīng)元特異抗原,并具備神經(jīng)細胞樣功能,可與GABA、甘氨酸、GLU等神經(jīng)遞質發(fā)生反應,產(chǎn)生單程動作電位。Tseng等[13]研究發(fā)現(xiàn),BMSCs在體外經(jīng)生長因子和化學處理后,可向神經(jīng)樣細胞分化,表達神經(jīng)元特異標記如神經(jīng)絲蛋白、β-微管蛋白Ⅲ、Tau蛋白,少量神經(jīng)樣細胞可分泌GABA。諸多體外研究都發(fā)現(xiàn)BMSCs可能具有功能性神經(jīng)細胞分化潛能[9,13],且可來源于自體、取材方便、并可避免免疫排斥反應等,是理想的種子細胞[14]。體內研究也證實 BMSCs在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應用價值。Shen等[15]將BMSCs移植治療大腦中動脈閉塞腦動物模型,發(fā)現(xiàn)細胞移植治療2周后腦缺血動物的神經(jīng)缺失癥狀開始得到改善,且療效至少可持續(xù)1年;原位雜交反應顯示,移植后的細胞可在宿主腦內存活并部分[(22.3±1.95)%]表達星形膠質細胞特異性膠質纖維酸性蛋白(glia fibrillary acidic p rotein,GFAP),部分[(16.8±2.13)%]表達神經(jīng)元特異性微管相關蛋白-2(microtubu le associated p rotein-2,MAP-2),增加缺血組織周圍突觸囊泡蛋白表達,明顯減輕突觸缺失。BMSCs作為基因治療的載體細胞應用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究也曾有報道,Lu等[16]利用腺相關病毒載體將多巴胺生成限速酶-酪氨酸羥化酶(ty rosine hydroxylase,TH)基因導入BMSCs,然后將表達 TH基因的 BMSCs移植到帕金森病模型鼠的紋狀體內后觀察發(fā)現(xiàn),治療組阿撲嗎啡誘導的不對稱旋轉癥狀較對照組明顯減輕,6周后免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)TH基因主要在移植點周圍表達,高效液相色譜儀及電化學檢測證實TH基因修飾的BMSCs紋狀體內移植可明顯增加移植點周圍多巴胺遞質水平。

目前有關GAD67基因修飾的BMSCs致癇灶內定向移植治療癲癇的研究還未曾見報道。本實驗研究證實,利用基因重組技術構建的帶有綠色熒光標記的GAD67基因真核表達載體pDC316-CM V-EGFP-GAD67可通過脂質體有效轉入BMSCs中,并在轉染后的BMSCs中呈陽性表達,提示外源GAD67基因可在 BMSCs中有效表達,為下一步GAD67基因修飾的BMSCs致癇灶內定向移植治療癲癇的研究奠定了實驗基礎。但在本研究中還發(fā)現(xiàn)存在轉染效率不高(37.3%),轉染后GAD67基因在BMSCs中的表達不夠理想,GAD67陽性細胞僅為(15.6±4.15)%,長時間加壓篩選培養(yǎng)后外源基因在BMSCs中的表達有衰減趨勢,轉染后的細胞增殖能力下降等一系列問題,而且轉染后GAD67基因能否在轉染細胞中表達功能性GAD67蛋白,有效增加細胞內外抑制性神經(jīng)遞質GABA濃度,還有待后期進一步探究。

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To Construct Eukaryotic Expression Vector with GAD67 Gene and Transfect It into Bone Marrow

Strom al Cells

XIE San-ping▲,CHEN Ji-xiang,L I H ui,XU Jing,HUANG Yuan-yuan.▲Departmentof Neurology,Union Hospital,Tongji Med ical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,China

Ob jective:To constructhuman g lutamic acid decarboxy lase(GAD67)gene's recombinant eukaryotic expression vector pDC316-CMV-EGFP-GAD67 and to transfect it into bone marrow strom al cells(BMSCs)of rats.Methods:Eukaryotic exp ression vector pDC316-CMVEGFP-GAD67 was constructed with the technique of gene rearrangement.BMSCs of rats were cultivated by their adherence-dependent growth character,and the recombinant pDC316-CMVEGFP-GAD67 was transferred into the BSMCswith lipofectam ineTM2000.The cellswere observed by fluorescencemicroscopy,the efficiency of transfection was assessed by flow cytometry,and the expression of GAD67 protein in BMSCs w as detected by immunohistochemistry after transfecting.Results:The pDC316-CMV-EGFP-GAD67was constructed successfu lly.Green fluorocy tes were detected under fluorescence microscopy after transfection and the efficiency of transfection w as 37.3%at 48 hours post transfection.GAD67p rotein exp ressed in tansfected BM SCs at 48 hours post transfection.Conclusion:The eukaryotic expression vector pDC316-CMV-EGFPGAD67 was successfully constructed and effectively transfected into BMSCs.

g lutamic acid decarboxy lase67;eukaryotic exp ression vector;transfection;boneMarrow stromal cells

Q782;R742.2

A

1001-117X(2011)04-0235-06

10.3870/sjsscj.2011.04.001

湖北省科技攻關計劃項目(No.GGS0064)

2011-06-09