應(yīng)用幾丁糖-膠原-二丙酸倍他米松緩釋復(fù)合膜提高周?chē)窠?jīng)修復(fù)療效的實(shí)驗(yàn)研究

陸九州,蔣軍健,徐建光,徐文東,徐雷,勞杰,顧玉東

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院手外科,上海200040

神經(jīng)縫合口局部的疤痕增生是阻礙周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)的一個(gè)重要原因[1,2]。疤痕組織可與損傷神經(jīng)粘連、直接壓迫、并影響神經(jīng)血供;也可生長(zhǎng)入縫合口間隙,阻礙近端再生的神經(jīng)纖維通過(guò)縫合口,阻礙神經(jīng)再生,影響其功能恢復(fù)。本研究將二丙酸倍他米松(甾體類(lèi)激素)加入具有緩釋功能的幾丁糖-膠原復(fù)合膜中,應(yīng)用于神經(jīng)縫合口周?chē)?觀察其促進(jìn)神經(jīng)再生、提高神經(jīng)功能恢復(fù)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動(dòng)物:健康雄性SD大鼠36只,體質(zhì)量(150±10)g,由中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。②主要試劑與材料:酸溶性幾丁糖(購(gòu)于上海其勝生物制劑有限公司);膠原(購(gòu)于Sigma公司);二丙酸倍他米松(購(gòu)于比利時(shí)先靈葆雅公司);聚-DL-乳酸膜(購(gòu)于成都迪康中科生物醫(yī)學(xué)材料有限公司);神經(jīng)絲蛋白(Neurofilament,NF)兔多克隆抗體(購(gòu)于美國(guó)Abcam公司),異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)標(biāo)記的羊抗兔IgG(購(gòu)于美國(guó)Sigma公司)。Phasis四道程肌電誘發(fā)儀(購(gòu)于意大利 ESAOTE公司);Axiocam M R R3熒光顯微鏡(購(gòu)于德國(guó)Carl Zeiss公司)。

1.2 方法

1.2.1 幾丁糖-膠原-二丙酸倍他米松緩釋放系統(tǒng)制備 3%酸溶性幾丁糖與1.5%膠原以1∶9混合,再逐漸加入二丙酸倍他米松混懸液,各1 mL,充分混合60 min,200轉(zhuǎn)/min攪拌下逐漸滴入36%甲醛2 mL,5 min后灌入模具內(nèi),靜置1 h后脫模,蒸餾水清洗后冰凍真空抽干機(jī)間斷干燥12 h,4℃下存放。

1.2.2 分組與手術(shù) SD大鼠隨機(jī)分為A、B、C組,各組 12只。10 g/L戊巴比妥鈉40 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉大鼠,俯臥位固定。取大鼠右股后部斜切口,在手術(shù)顯微鏡(×6)下解剖脛神經(jīng),距脛神經(jīng)入腓腸肌以近約1.5 cm切斷,以神經(jīng)外膜上血管走行為標(biāo)記,9-0無(wú)損傷線縫合神經(jīng)外膜4針,針距與邊距大小以使軸突不膨出、外膜不內(nèi)翻為宜。A組:神經(jīng)切斷后直接縫合;B組:神經(jīng)切斷后直接縫合,在吻合口包裹長(zhǎng)度為10 mm的聚-DL-乳酸膜;C組:神經(jīng)切斷后直接縫合,在吻合口包裹長(zhǎng)度為10 mm的幾丁糖-膠原-二丙酸倍他米松復(fù)合膜。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè) 于術(shù)后4、8及12周進(jìn)行各指標(biāo)檢測(cè)。①肉眼觀察:取材時(shí)切開(kāi)傷口觀察皮膚、肌肉和筋膜愈合情況;神經(jīng)吻合口與周?chē)∏幌墩尺B情況;聚-DL-乳酸膜和幾丁糖-膠原-二丙酸倍他米松復(fù)合膜在體內(nèi)降解吸收情況。②電生理檢查:麻醉(方法同上),顯露手術(shù)側(cè)脛神經(jīng),Phasis四道程肌電誘發(fā)儀檢測(cè),在神經(jīng)近端刺激,腓腸肌記錄并計(jì)算運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度和動(dòng)作電位波幅。③組織學(xué)檢測(cè):電生理檢測(cè)完畢后取材,以脛神經(jīng)吻合為中心切取神經(jīng)約1 cm,標(biāo)記后以4%多聚甲醛固定24 h,梯度乙醇脫水,常規(guī)石蠟包埋固定,縱切面連續(xù)切片,免疫熒光染色檢測(cè)NF蛋白表達(dá)(一、二抗的稀釋比例均為1∶200),熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù),計(jì)量資料以(±s)表示,組間比較采用獨(dú)立樣本均數(shù) t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 傷口肉眼觀察 術(shù)后4周,幾丁糖-膠原復(fù)合膜導(dǎo)管的形狀保持不變,未被壓扁,聚-DL-乳酸膜則降解吸收;術(shù)后8周,幾丁糖-膠原復(fù)合膜明顯降解吸收;術(shù)后12周,幾丁糖-膠原復(fù)合膜完全降解吸收。術(shù)后 12周,A組的神經(jīng)縫合口處增粗,與周?chē)M織粘連明顯;B組的神經(jīng)縫合口處增粗,與周?chē)M織粘連不明顯;C組的神經(jīng)縫合口光滑,與周?chē)M織無(wú)明顯粘連,見(jiàn)圖1A-C。

2.2 電生理檢測(cè)結(jié)果 術(shù)后4周,B、C組的肌電檢測(cè)偶見(jiàn)電位,A組為電靜息;術(shù)后 8周,刺激神經(jīng)遠(yuǎn)、近端及導(dǎo)管處,3組均出現(xiàn)復(fù)合肌肉動(dòng)作電位(compound muscle action potential,CMAP),B、C組的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度和CMAP的波幅均高于A組(P＜0.05),B組與C組間運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度和CM AP的波幅差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;術(shù)后 12周,B、C組的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度和CMAP的波幅均高于A組(P＜0.05),C組CMAP的波幅高于B組(P＜0.05),B組與C組間運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表1、圖2。

圖1 A-C 術(shù)后12周,A組(A),B組(B)及C組(C)神經(jīng)縫合處生長(zhǎng)愈合情況

表1 術(shù)后8及12周3組神經(jīng)電生理檢查結(jié)果比較(±s)

表1 術(shù)后8及12周3組神經(jīng)電生理檢查結(jié)果比較(±s)

與A組比較,①P＜0.05;與B組比較,②P＜0.05

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圖2 術(shù)后12周神經(jīng)電生理(CMAP波幅)檢測(cè)結(jié)果 C組(綠色曲線)明顯高于B組(紅色曲線)及A組(黃色曲線),B組高于A組

2.3 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果 術(shù)后12周,NF熒光染色結(jié)果顯示,各組均有再生神經(jīng)纖維通過(guò)吻合口向遠(yuǎn)端生長(zhǎng)。C組見(jiàn)較多再生神經(jīng)軸突,排列較為整齊,B組次之,A組最差,見(jiàn)圖3A-C。

3 討論

周?chē)窠?jīng)損傷發(fā)生率高、治療效果差,神經(jīng)縫合口局部的疤痕增生是阻礙周?chē)窠?jīng)損傷后修復(fù)療效提高的重要原因。神經(jīng)修復(fù)術(shù)后局部產(chǎn)生血腫,來(lái)自不同部位的成纖維細(xì)胞游移并侵入血腫,在炎性細(xì)胞釋放的炎性介質(zhì)、生長(zhǎng)因子趨化刺激下,成纖維細(xì)胞向創(chuàng)口內(nèi)聚集、增殖、合成、分泌膠原纖維,逐漸形成疤痕組織。疤痕組織主要通過(guò)2種方式影響神經(jīng)功能的恢復(fù):①與損傷神經(jīng)粘連,直接壓迫神經(jīng),并影響神經(jīng)的血供;②疤痕生長(zhǎng)入縫合口間隙,阻礙近端再生的神經(jīng)纖維通過(guò)。因此,單純應(yīng)用各種促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)的藥物或其它手段,往往不能獲得理想的效果。預(yù)防周?chē)窠?jīng)術(shù)后的疤痕增生,提高周?chē)窠?jīng)修復(fù)療效,改善功能恢復(fù),成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

圖3 A-C 術(shù)后12周神經(jīng)縫合口縱切面NF免疫熒光染色結(jié)果 A:A組,再生神經(jīng)纖維扭曲,排列不整齊,通過(guò)縫合口的纖維數(shù)量少;B:B組,再生神經(jīng)纖維較直,排列尚整齊,通過(guò)縫合口的纖維數(shù)量增加;C:C組,再生神經(jīng)纖維較直,排列整齊,通過(guò)縫合口的纖維數(shù)量明顯增加(熒光顯微鏡,×200)

目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)踐方面進(jìn)行了大量的嘗試[3],主要集中在2個(gè)方面:①利用生物制劑阻隔神經(jīng)縫合口和周?chē)M織以達(dá)到物理防粘連的效果;②利用甾體類(lèi)激素抑制炎癥反應(yīng)的藥理作用,防止疤痕增生;但總體效果均不令人滿意。目前臨床應(yīng)用較多的生物制劑主要有幾丁糖、透明質(zhì)酸鈉及聚-DL-乳酸膜等防粘連劑[4-6]。防粘連劑有廣譜的抑菌作用和輕度止血效應(yīng),可選擇性抑制成纖維細(xì)胞生成及抑制粒細(xì)胞遷移和吞噬作用,臨床用于預(yù)防術(shù)后疤痕粘連,有一定效果;但這類(lèi)制劑降解、吸收較快,作用時(shí)間受到限制。甾體類(lèi)激素雖可抑制炎癥反應(yīng),通過(guò)多種途徑減少疤痕形成,但局部用藥作用時(shí)間短,全身長(zhǎng)期用藥則副作用較大。如能將這兩方面結(jié)合,既可物理阻隔,又可延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間,減少副作用,有效抑制疤痕增生、促進(jìn)神經(jīng)再生。

通過(guò)對(duì)材料組分、組成比、分子量、分子量分布等的控制,可合成各種不同降解速度及力學(xué)性能的生物膜。同時(shí),緩釋、控釋等藥物制劑類(lèi)型能使藥物的安全性、有效性和適應(yīng)性都有所提高,該技術(shù)在抗炎及抗腫瘤等方面都顯示出應(yīng)用價(jià)值[7-10],在促進(jìn)神經(jīng)再生方面也已有一些嘗試[11,12]。幾丁糖-膠原復(fù)合膜就是一種新型的生物可降解材料,既具備幾丁糖和膠原的優(yōu)點(diǎn),又增加了材料的柔韌性,延長(zhǎng)降解時(shí)間[13-15]。

本研究將長(zhǎng)效甾體類(lèi)激素二丙酸倍他米松加入幾丁糖-膠原復(fù)合膜中,應(yīng)用于神經(jīng)縫合口周?chē)?。一方面防止致密疤痕組織長(zhǎng)入神經(jīng)縫合口,使更多的再生軸突通過(guò)縫合口,到達(dá)靶器官;另一方面通過(guò)緩慢、持續(xù)釋放甾體類(lèi)激素,防止神經(jīng)周?chē)毯墼錾?減少疤痕組織對(duì)損傷神經(jīng)的卡壓及對(duì)血供的影響。結(jié)果顯示,應(yīng)用該復(fù)合膜后,神經(jīng)縫合口周?chē)毯墼錾@著減少,與周?chē)M織粘連不明顯;在體內(nèi)該復(fù)合膜降解吸收明顯慢于聚-DL-乳酸膜。組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)再生神經(jīng)軸突數(shù)量高于其它2組,且排列較為整齊。電生理檢查顯示應(yīng)用該復(fù)合膜后,運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度與聚-DL-乳酸膜組相比無(wú)明顯差異,但 12周時(shí),CM AP的波幅高于聚-DL-乳酸膜組。

綜上所述,將加入二丙酸倍他米松的幾丁糖-膠原復(fù)合膜包裹于神經(jīng)周?chē)?借助其物理隔離及緩慢釋放甾體激素的功能,產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng),可起到持久、恒定的疤痕抑制作用,達(dá)到促進(jìn)神經(jīng)再生、提高神經(jīng)功能恢復(fù)的作用。為解決促進(jìn)周?chē)窠?jīng)再生難題提供一種新的方法。

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