益氣養(yǎng)血 利濕通絡方對氟中毒大鼠抗氧化作用的研究

申惠鵬，喻茂娟，王 丹

（1.遵義醫(yī)藥高等?？茖W校，貴州 遵義 563002；2.貴陽醫(yī)學院，貴州 貴陽 550004）

氟是一種化學性質活潑的非金屬元素，氟除惰性氣體外，能與所有元素結合，氟化合物廣泛存在于空氣、土壤、水源、動植物體內(nèi)，人過量攝氟會引起機體內(nèi)自由基和脂質過氧化物增多，但氟致機體自由基升高的機理并不十分清楚。氟是負性極強的元素，它本身不可能與體內(nèi)氧形成自由基。但氟可刺激多形核白細胞（PMN）發(fā)生呼吸爆發(fā)，消耗氧氣，釋放超氧陰離子自由基（·O2-）和一氧化氮（NO）[1]。已有研究證實，采用電子自旋共振（ESR）法檢測氟中毒大鼠腎臟自由基含量，發(fā)現(xiàn)染氟組自由基含量明顯高于正常對照組和抗氧化中藥組[2]。從治療上來說，對氟中毒的治療原則強調(diào)增強機體新陳代謝，促進氟化物的排泄[3]。

中醫(yī)學認為，氟中毒為外界環(huán)境濕（毒）氣侵及機體，傷及肝氣腎精，致肝腎虧虛，使筋骨受損，經(jīng)絡阻滯，血行不暢；日久氣滯血瘀，筋骨失養(yǎng)，筋脈痹阻不暢而發(fā)生關節(jié)屈伸不利、行走困難[4]。本研究本著中醫(yī)扶正祛邪、除痹治標、祛氟治本、標本兼治的原則[5]，從貴州豐富的中藥材中選取黃芪、當歸、海風藤、金錢草等組成益氣養(yǎng)血、利濕通絡中藥復方劑，擬通過動物實驗篩選出能治療亞慢性氟中毒的中藥，并通過其對抗氧化指標的影響研究藥效機制。在我國以辨證論治為指導，施以補氣和血、強筋健骨、疏經(jīng)通絡為主治療慢性氟中毒的基礎上，探索理想的中藥復方劑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑 氟化鈉（NaF）（分析純，由成都市聯(lián)合化工試劑研究所生產(chǎn)）、蛋白測定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、谷朧甘膚過氧化物酶（GSH-Px）測試盒、過氧化氫酶（CAT）測試盒、總抗氧化能力（T-AOC）測試盒、丙二醛（MDA）測試盒（由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)）。

1.1.2 實驗藥物 中藥復方劑的主要成分有黃芪、當歸、海風藤、金錢草等（由遵義醫(yī)藥高等專科學校提供）。

1.1.3 藥物制作 將各味藥材按處方的40倍稱取，盡量混勻，加水浸泡30分鐘，煎煮2次。第1次15倍用水量，煎煮1.5小時，沸騰前溫度調(diào)至105℃，沸騰后保持90℃，過濾；藥渣第2次8倍用水量，煎煮45分鐘，過濾，合并2次濾液。將合并濾液于水浴上蒸發(fā)濃縮，再置一般烘箱進一步濃縮和干燥處理后，粉碎處理成細粉狀，密封保存，備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 染毒劑量及分組 本實驗采用大鼠自由食用NaF 飼料的途徑染毒。染毒劑量設計依據(jù)查閱的參考文獻實驗結果，并參考亞慢性染毒實驗要求：通常取受試物LD50 的1/20～1/5 為最高劑量。參考文獻中，NaF 對雄性大鼠經(jīng)口染毒的LD50 為250 mg/kg，最后確定本次實驗高氟組染氟劑量為100 mg/kg，中氟組染氟劑量為50 mg/kg。高氟營養(yǎng)不良組染氟劑量為100 mg/kg，且飼料中蛋白含量及鈣含量減半，即每千克飼料中加入NaF110.5 mg，氟含量為50 mg/kg；每千克飼料中加入NaF221.1mg，氟含量為100 mg/kg。

染毒前適應性喂養(yǎng)一周（動物室相對濕度50%～60%）后，分層隨機將442只大鼠分為4組，正常對照組16只，中氟組、高氟組、高氟營養(yǎng)不良組各142只，分別食用不同氟含量的食物，自由飲用自來水，每周觀察大鼠生長發(fā)育狀況及牙齒變化情況，每組分別于180天、210天、240天時隨機抽取8只大鼠收集其24小時尿液，并在180天染毒結束時根據(jù)樣本量大小，正常對照組處死8只，其余每組處死16只。

染毒180天后開始中藥治療，中藥復方劑22.6 g 中藥干粉相當于每人每天1 劑復方的用量。根據(jù)《醫(yī)用實驗動物學》動物與人體的每公斤體重劑量折算系數(shù)表查得，人與大鼠折算系數(shù)（W）為6.25，人標準體重為70 kg，依照公式：大鼠用藥劑量（mg/kg）=W ×人用藥劑量（mg/kg），求得中藥復方劑大鼠每天劑量為194 mg/100 g。中藥干粉用蒸餾水配制成混懸液，每天1 ml/100 g經(jīng)口灌服，每周灌服6天，連續(xù)灌服90天后處死。

中藥治療階段動物分組及數(shù)量為對照組8只；中氟組、高氟組、高氟營養(yǎng)不良組每組再分為1個陽性對照組（18只）和中藥復方治療組（36只）灌服中藥，其中再分為正常飼料組18只和持續(xù)染氟組18只，分組情況見圖1。

圖1 中藥治療階段大鼠分組

1.2.2 實驗方法 尿氟含量測定采用氟離子選擇電極法，骨氟含量測定采用高溫灰化-氟離子選擇電極法，蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法，SOD 活性測定采用亞硝酸鹽法，GSH-Px 活力測定采用二硫代雙硝基苯甲酸（DTNB）直接法，T-AOC 水平測定采用比色法。CAT 含量測定采用比色法，MDA 含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）熒光法。

1.2.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS11.5 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行整理匯總，計量資料行Levene 方差齊性檢驗、單因素方差分析。方差齊采用LSD 或SNK 法進行兩兩比較，方差不齊采用校正后的方差分析后行TamhaneT2 或DunnettT3 法進行兩兩比較。用Microsoft Excel 2003 軟件繪制統(tǒng)計圖。

2 結果

2.1 尿樣及骨樣中氟含量測定（見表1）

染毒階段，各實驗組尿氟含量均高于正常對照組，且高氟組及高氟營養(yǎng)不良組與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各實驗組骨氟含量均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。治療階段，各陽性對照組尿氟、骨氟含量均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且240天尿氟含量高于210天尿氟含量。

治療組中的尿氟含量：中氟中藥復方劑組正常飼料組尿氟含量低于中氟組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。中藥復方劑組、正常飼料組在240天時尿氟含量也低于高氟組，差異有統(tǒng)計學意義；高氟營養(yǎng)不良中藥復方劑組的正常飼料組尿氟含量均低于高氟營養(yǎng)不良組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

治療組中的骨氟含量：中氟中藥復方劑組正常飼料組骨氟含量低于中氟組陽性對照組，高氟組中藥復方劑組低于高氟組，高氟營養(yǎng)不良組中中藥復方劑組骨氟含量低于高氟營養(yǎng)不良組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。提示復方劑組有一定的排氟作用。

表1 實驗大鼠尿氟和骨氟含量測定結果（ ±s）

表1 實驗大鼠尿氟和骨氟含量測定結果（ ±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與中氟組比較，bP＜0.05；與高氟組比較，cP＜0.05；與高氟營養(yǎng)不良組比較，dP＜0.05

分組尿氟（mg/L） 骨氟（mg/kg）180天 210天 240天 180天 270天1.14 ±0.297.56 ±2.42a 2.70 ±0.76b 10.65 ±4.1519.43 ±6.32a 3.59 ±1.87c 12.97 ±6.6934.32 ±9.50a 3.80 ±1.33d 14.49 ±6.18d正常對照組中氟組中氟中藥復方劑組高氟組高氟中藥復方劑組高氟營養(yǎng)不良組高氟營養(yǎng)不良中藥復方劑組陽性對照組正常飼料組持續(xù)染氟組陽性對照組正常飼料組持續(xù)染氟組陽性對照組正常飼料組持續(xù)染氟組1.24 ±0.372.53 ±0.6716.87 ±2.52188.39 ±46.43a 14.05 ±4.10198.16 ±26.94a 16.71 ±6.870.96 ±0.116.79 ±2.11a 2.63 ±1.31b 9.99 ±4.8310.88 ±3.34a 19.08 ±32.4311.84 ±16.1127.42 ±12.60a 3.30 ±0.26d 18.53 ±10.79261.05 ±90.62a 68.54 ±3.84223.95 ±21.54a 144.63 ±29.94b 185.91 ±54.86701.67 ±178.16a 312.54 ±31.48c 391.42 ±109.93c 794.66 ±261.35a 379.02 ±71.88d 492.18 ±49.31

表2 實驗大鼠肝臟抗氧化指標測定結果（±s）

表2 實驗大鼠肝臟抗氧化指標測定結果（±s）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與中氟組比較，bP＜0.05；與高氟組比較，cP＜0.05；與高氟營養(yǎng)不良組比較，dP＜0.05

分組 總 SOD 活力（U/ml） GSH-Px（U/ml） CAT（U/gHb） T-AOC（U/ml） MDA（nmol/ml）15.46 ±2.3116.62 ±3.0824.33 ±5.4522.48 ±8.5125.99 ±2.98a 18.15 ±4.01c 14.52 ±1.17c 27.10 ±3.49a 14.73 ±3.31d 18.15 ±5.82d正常對照組中氟組中氟中藥復方劑組高氟組高氟中藥復方劑組高氟營養(yǎng)不良組高氟營養(yǎng)不良中藥復方劑組陽性對照組正常飼料組持續(xù)染氟組陽性對照組正常飼料組持續(xù)染氟組陽性對照組正常飼料組持續(xù)染氟組132.49 ±1.6891.50 ±2.28a 113.76 ±13.80b 113.55 ±0.54b 102.41 ±12.34a 122.70 ±13.66c 129.24 ±0.62c 90.57 ±7.11a 105.33 ±24.07d 117.15 ±1.16d 444.02 ±32.95258.15 ±87.00a 348.95 ±24.90b 209.66 ±97.28186.49 ±99.56a 236.67 ±16.37289.35 ±41.83c 140.39 ±18.60a 155.05 ±65.08265.08 ±77.91d 45.22 ±5.9982.85 ±17.70a 94.66 ±21.1992.90 ±17.3994.30 ±11.36a 93.25 ±8.5591.87 ±16.7687.30 ±14.12a 90.19 ±11.7698.15 ±21.01254.46 ±14.21149.43 ±19.87a 301.19 ±132.41380.56 ±38.58b 127.48 ±15.26a 446.22 ±133.02154.24 ±19.73108.22 ±2.54a 114.24 ±7.72352.37 ±123.08d

表3 實驗大鼠腎臟抗氧化指標測定結果（±s）

表3 實驗大鼠腎臟抗氧化指標測定結果（±s）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與中氟組比較，bP＜0.05；與高氟組比較，cP＜0.05；與高氟營養(yǎng)不良組比較，dP＜0.05

分組 總 SOD 活力（U/ml） GSH-Px（U/ml） CAT（U/gHb） T-AOC（U/ml） MDA（nmol/ml）48.72 ±11.7078.61 ±3.96a 106.96 ±26.2484.63 ±2.04b 111.40 ±37.51a 146.89 ±50.60162.13 ±32.32111.59 ±10.15a 82.08 ±5.96119.83 ±10.90正常對照組中氟組中氟中藥復方劑組高氟組高氟中藥復方劑組高氟營養(yǎng)不良組高氟營養(yǎng)不良中藥復方劑組陽性對照組正常飼料組持續(xù)染氟組陽性對照組正常飼料組持續(xù)染氟組陽性對照組正常飼料組持續(xù)染氟組103.52 ±0.1776.27 ±7.86a 84.96 ±18.4474.90 ±13.6179.45 ±8.58a 130.49 ±13.42c 103.84 ±16.18c 106.17 ±18.4266.95 ±15.3797.46 ±3.45128.16 ±26.9692.89 ±9.98a 97.58 ±61.9090.19 ±45.7581.76 ±24.27a 170.23 ±59.03c 137.07 ±21.70c 72.36 ±12.35a 98.05 ±16.47d 96.31 ±36.2842.11 ±14.8350.79 ±21.1763.82 ±32.01135.06 ±103.5193.80 ±5.98a 130.80 ±53.6372.57 ±32.84106.85 ±11.41a 55.52 ±15.74d 83.84 ±24.37157.64 ±38.62136.02 ±20.66173.94 ±66.40113.14 ±19.10117.32 ±17.27a 209.13 ±18.17c 149.33 ±32.5896.96 ±34.71a 86.18 ±4.15139.73 ±8.19d

2.2 肝臟抗氧化指標測定（見表2）

SOD 活性，所有陽性對照組均低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；中藥復方劑組正常飼料組和持續(xù)染氟組SOD活性均高于中氟組；高氟中藥復方劑正常飼料組和持續(xù)染氟組高于高氟組；高氟營養(yǎng)不良中藥復方劑組的正常飼料組和持續(xù)染氟組的SOD 活性高于高氟營養(yǎng)不良組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

GSH-Px 活性，所有陽性對照組均低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；中氟中藥復方劑組正常飼料組GSH-Px活性介于中氟組和正常對照組之間，且高于中氟組；高氟中藥復方劑組持續(xù)染氟組GSH-Px 活性介于高氟組和正常對照組之間，且高于高氟組；高氟營養(yǎng)不良中藥復方劑組持續(xù)染氟組GSH-Px 活性介于高氟組和正常對照組之間，且高于高氟組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

CAT 含量，所有陽性對照組均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。中藥復方劑組對降低CAT 活性無明顯作用。

T-AOC 水平，所有陽性對照組均低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高氟中藥復方劑組持續(xù)染氟組高于高氟營養(yǎng)不良組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

MDA 含量，高氟組、高氟營養(yǎng)不良組高于正常對照組，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高氟中藥復方劑組的正常飼料組肝臟MDA含量介于高氟組和正常對照組之間，且低于高氟組，有統(tǒng)計學意義，高氟中藥復方劑組持續(xù)染氟組MDA 含量低于高氟組；高氟營養(yǎng)不良中藥復方劑組正常飼料組和持續(xù)染氟組MDA 含量低于高氟營養(yǎng)不良組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 腎臟抗氧化指標測定（見表3）

SOD 活性，中氟組、高氟組SOD 活性低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高氟中藥復方劑組的正常飼料組和持續(xù)染氟組SOD 活性高于高氟組，且正常飼料組SOD 活性高于持續(xù)染氟組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

GSH-Px 活性，所有陽性對照組均低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高氟中藥復方劑組持續(xù)染氟組和正常飼料組GSH-Px 活性高于高氟組；高氟營養(yǎng)不良中藥復方劑組的正常飼料組GSH-PX活性高于高氟組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

CAT 含量，高氟組、高氟營養(yǎng)不良組高于正常對照組，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高氟營養(yǎng)不良中藥復方劑組的正常飼料組CAT 低于高氟營養(yǎng)不良組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

T-AOC 水平，高氟組、高氟營養(yǎng)不良組低于正常對照組，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高氟中藥復方劑組的正常飼料組總抗氧化能力高于高氟組；高氟營養(yǎng)不良組中藥復方劑組的持續(xù)染氟組高于高氟營養(yǎng)不良組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

MDA 含量，所有陽性對照組均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高氟營養(yǎng)不良中藥復方劑組的正常飼料組MDA 含量低于高氟營養(yǎng)不良組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

目前，發(fā)現(xiàn)抗氧化作用的單味中藥有：黃芪、銀杏、淫羊藿、海風藤、紅景天、蕓香豆、枸杞、五味子、甘草、當歸、赤芍、川芎、人參、蛤蚧、生姜、大棗等；中藥復方制劑有歸脾湯、六味地黃丸、逍遙散、人參湯、復方何首烏片、益氣活血方、復方丹參湯等[6，7]。研究發(fā)現(xiàn)，這些藥物中大多含有酯類、生物堿類、酮類、鞣質類等抗氧化成分，可清除羥自由基、氧自由基、H2O2、單線態(tài)氧等活性氧，它們對氧化損傷導致的多種疾病有很好的治療效果。

尿氟和骨氟含量會隨染氟時間增長而升高，經(jīng)過中藥復方劑的治療，中藥復方劑組尿氟、骨氟含量較各自的陽性對照組低，說明中藥復方劑可減少氟在機體內(nèi)的蓄積。

本研究提示，中藥復方劑可有效提高肝臟和腎臟抗氧化能力。中藥復方劑的主要成分黃芪、當歸中含有豐富的抗氧化成分和微量元素，不僅可直接增強抗氧化力，還為金屬酶提供了輔酶，使其活性提高，對抗自由基。目前亦有研究發(fā)現(xiàn)，多種抗氧化類中藥中微量元素豐富，其中Fe 元素含量較高[8]。

評判抗氧化力的重要指標有SOD 和GSH-Px，其中SOD 是廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬酶，能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應，可平衡機體內(nèi)的氧自由基。所以，當機體發(fā)生氟中毒時，自由基水平的增高勢必會大量消耗SOD，使之活性降低。另外，依據(jù)金屬輔基的不同成分可將SOD分為3類，第一類含銅和鋅，稱為銅鋅超氧化物歧化酶，主要存在于真核細胞和細胞漿中；第二類含錳，稱為錳超氧化物歧化酶，存在于真核細胞的線粒體和原核細胞中；第三類含鐵，稱為鐵超氧化物歧化酶，只存在于原核細胞中[9]。因此，機體內(nèi)金屬微量元素的減少或失衡會造成SOD 活性降低。

GSH-Px 是機體內(nèi)廣泛存在的重要的過氧化物分解酶。機體中的自由基或過氧化氫可將GSH-Px 中的硒醇離子氧化成硒次磺酸衍生物和羥基化合物，然后由GSH 供氫，與硒次磺酸衍生物作用后產(chǎn)生酶-底物復合物和水，酶-底物復合物再與GSH 反應，生成原來的GSH-Px 與氧化型谷胱甘肽（GSSG），從而將自由基或H2O2還原成羥基化合物和H2O，同時氧化型GSSG 再由谷胱甘肽還原酶（GR）還原為GSH[10]，所以GR 活力的降低，GSSG 還原為GSH 的能力下降，會使GSH 含量減少[11]，作為供氫體的GSH 的減少勢必引起GSH-Px 活性的下降。

染氟后，AOS 的增加可直接消耗SOD 和GSH-Px 而使其含量下降。中藥復方劑有一定降低CAT 活性的能力，并有清除MDA 的效果。CAT 和MDA 都是脂質過氧化過程中的中間產(chǎn)物，其中MDA可交聯(lián)蛋白質和磷脂的氨基，影響膜流動性，使膜脆性增加，其含量的變化可間接反映組織中氧自由基含量的變化。所以中藥復方劑提高抗氧化力的同時還可減少脂質過氧化物含量。

抗氧化指標和脂質過氧化指標均顯示，大鼠食用高氟飼料6個月后中藥灌胃，即食高氟飼料的同時實施中藥治療，亦可改善抗氧化指標，顯示中藥復方劑對機體長期處于高氟環(huán)境，體內(nèi)氟積累達較高程度時，仍具有抗氧化能力；在正常飼料組中也有明顯效果，說明脫離高氟條件時應用中藥仍可加速體內(nèi)氟的排出。但是由于氟對肝、腎造成不可逆的損害，所以持續(xù)染氟組和正常飼料組之間的差異無統(tǒng)計學意義。

綜上所述，益氣養(yǎng)血、利濕通絡中藥復方劑能提高肝、腎抗氧化酶SOD、GSH-Px 的活性，亦能提高T-AOC 水平，同時還可降低MDA 含量。

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