結核分枝桿菌環(huán)介導恒溫擴增（LAMP）快速檢測方法的評價

戴廣明 曹以誠 杜正平 陳洵 黃曙海 逄宇 周楊 黃海榮 趙雁林

（1.北京結核病胸部腫瘤研究所 北京 101149；2.華南理工大學 廣州 510640；3.廣西疾病預防控制中心 南寧 530000）

細菌學檢查是發(fā)現(xiàn)結核病傳染源的主要途徑和手段，是確定結核病診斷和化療方案的重要依據(jù)。但由于敏感性低或所需時間過長等原因，致使結核病細菌學檢查一直不能滿足臨床診治的需求，存在延誤診斷和誤診情況，同時也耽誤了患者得到及時治療的時間，影響了治療效果，也使得疾病的傳播難于控制。因此，缺乏早期、準確和廉價的診斷技術是制約全球結核病控制的嚴重障礙。

近年發(fā)展起來的環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP），完全突破了傳統(tǒng)分子生物學檢測技術需要昂貴儀器設備以及繁雜操作的限制，給分子生物學診斷技術的廉價普及帶來了希望。該方法最初是由Notomi等［1]設計來用于病原微生物的檢測，技術的工作原理是利用4條不同的特異性引物識別靶基因的6個特定區(qū)段，在等溫條件下進行擴增反應?；虻臄U增和產(chǎn)物的檢測可一步完成，擴增效率高，可在15～60min擴增109～1010倍。所有靶基因序列的檢測可只通過擴增產(chǎn)物的有、無來判別。結果的判斷很簡單，主要有以下兩種方式：（1）反應結束后直接在紫外燈光下判讀有無擴增反應產(chǎn)物形成；（2）核酸大量合成時，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2＋結合，產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀，應用濁度儀檢測沉淀濁度來判定［2]。由于方法簡單易行，即使是沒有分子生物學實驗經(jīng)驗的技術人員也只需1周的訓練就可掌握。

本文對國內建立的結核分枝桿菌環(huán)介導恒溫擴增（LAMP）快速檢測方法進行了介紹和評價，結果如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 本室保存的31株分枝桿菌標準菌株，48株臨床結核分枝桿菌。

1.1.2 結核分枝桿菌（LAMP法）基因快速檢測試劑盒（以下簡稱LAMP檢測試劑盒）由我們和華南理工大學共同研發(fā)，基因組DNA純化試劑盒（Genomic DNA Purification Kit）購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 檢測目標菌株和靶標引物 結核分枝桿菌基因快速檢測方法的目標菌株確定為結核分枝桿菌復合群，包括結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）、牛結核分枝桿菌（Mycobacterium bovis）、非洲結核分枝桿菌（Mycobacterium africanum）和田鼠結核分枝桿菌（Mycobacterium microti）。根據(jù)相關文獻報道［3]和預實驗，靶標確定為編碼DNA解旋酶B亞基的gyrB基因，通過序列分析獲得保守區(qū)域設計引物（圖1），內引物為FIP和BIP，外引物為F3和B3（引物設計軟件為華南理工大學開發(fā)的LAMP引物設計專用軟件）。引物序列為FIP：ACCGTTGACCCCGTCTTCTTGttttAGAAGTCGGAACCCCT 和 BIP：ATACGACTTCGAAACCGTCGCCttttGGTCAGCCCCTTGTTGAG， F3： GGGTACGAGTGGTCTCAGG，B3：CGTCTTGGGTCACCCTCT。

1.2.2 DNA模板制備 取對數(shù)生長期的分枝桿菌標準菌株和臨床結核分枝桿菌，用滅菌蒸餾水分別懸浮于1.5ml離心管中高溫滅菌后，8000r／min離心5min，取上清液轉移至另一離心管中作為粗制模板DNA?；驅⑸锨逡汉图毎恋碛没蚪MDNA純化試劑盒（Genomic DNA Purification Kit）提取基因組DNA作為精制的模板DNA。

圖1 目標菌gyrB基因序列高度一致的保守區(qū)域（紅框中是引物識別靶基因的6個特定區(qū)段）

圖2 LAMP反應結果（綠色的是有發(fā)生特異性擴增的陽性管，橙色的為陰性管）

1.2.3 LAMP擴增反應 結核分枝桿菌（LAMP法）基因快速檢測試劑盒包括20支LAMP反應管和陽性標準管、陰性標準管各1支。每支LAMP反應管為1個LAMP反應體系，分為大小2個腔。大腔含有1.6μmol／L FIP引物、1.6μmol／L BIP 引物、0.4μmol／L F3 引 物、0.4μmol／L B3 引 物、1mol／L Betaine溶液、6mmol／L MgSO4溶液、8U Bst DNA 聚合酶、1.6mmol／L dNTP溶液、2.5μL 10×Thermo Pol Buffer，小腔含2μL核酸染料，最后上面覆蓋一層石蠟油（25μL）以防止污染。陽性標準為卡介苗核酸溶液，陰性標準為樣品處理液。將粗制模板DNA 2.5μL或精制模板DNA 1μL加入LAMP反應管的大腔底部，置65℃恒溫反應60min即可。每次反應都應加陰性標準模版、陽性標準模版作為對照。

1.2.3 PCR擴增反應 在50μl PCR反應體系中進行擴增反應，含有10×緩沖液5μl，上下游引物各 0.1μM （F3：GGGTACGAGTGGTCTCAGG，B3： CGTCTTGGGTCACCCTCT ）， 0.2mM dNTP，2μM MgCl2，1.5UTaq DNA 聚合酶及100ngDNA模板。在PE－9700擴增儀上94℃預變性5min后，進行30次下述循環(huán)：94℃1min，58℃1min和72℃1min，72℃延伸7min。最后取5μl PCR擴增產(chǎn)物，在1.5%瓊脂糖凝膠（其中含40μl／ml溴乙錠）中進行電泳，時間為1h。電泳完畢，用讀膠儀拍照，并用標準DNA 1 500bp ladder進行帶型大小比較結果判定。

1.2.4 結核桿菌H37Rv基因組DNA稀釋實驗取結核桿菌H37Rv培養(yǎng)物作為原液，用滅菌蒸餾水懸浮于1.5ml離心管，高溫滅菌后，用純化試劑盒（Genomic DNA Purification Kit）提取基因組DNA作為底液作10倍梯度稀釋，共稀釋10個梯度。然后以其做模版進行l(wèi)amp檢測。

1.2.5 重復對照實驗 分別由本室實驗員和華南理工大學實驗員對相同的樣品進行重復對照測試。

1.2.6 結果判斷 取出反應管，冷卻至室溫，顛倒LAMP反應管，使大小腔反應物混勻。其結果可以通過肉眼觀察到的顏色變化來判斷，顏色立即變綠的是有發(fā)生特異性擴增的陽性管，變橙色的為陰性管。若陰陽性對照反應管結果與上述情況不符，則本次檢測結果無效，應重新檢測。

2 結果

2.1 LAMP反應的靈敏度和特異性試驗 取本室保存分枝桿菌31株標準菌株和48株臨床結核分枝桿菌的DNA模板進行LAMP反應，結果如表1和圖2所示。從圖2可以看到，顏色立即變綠的是發(fā)生特異性擴增的陽性管，變橙色的為陰性管。在相同反應條件下，LAMP方法能迅速的檢測出結核桿菌復合群，包括結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）、牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis）、非洲分枝桿菌（Mycobacterium africanum）和田鼠分枝桿菌（Mycobacterium microti）。華南理工大學的檢測結果為56株菌為陽性，23株菌為陰性，其中潰瘍分枝桿菌（M.ulcerans）和鳥分枝桿菌（M.avium）不屬于結核分枝桿菌復合群的菌株也為陽性。以實驗菌株培養(yǎng)和16SrRNA測序結果作為金標，從表2可計算得出特異度為92.0%，靈敏度為100.0%。北京結研所的檢測結果為57株菌為陽性，22株菌為陰性，其中恥垢分枝桿菌（M.smegmatis）、副偶發(fā)分枝桿菌（M.parofortuitum）和不產(chǎn)色分枝桿菌（M.nonchromogenicum）不屬于結核桿菌復合群的菌株也為陽性。從表3可計算得出特異度為88.0%，靈敏度為100.0%。PCR擴增和金標的結果相同，都是54株菌為陽性，25株菌為陰性。

表1 實驗菌株PCR擴增和LAMP檢測結果

表2 華南理工大學LAMP檢測結果a

表3 北京結研所檢測結果a

2.1 LAMP反應最低檢出限的計算 將結核桿菌H37Rv提取基因組DNA并稀釋10個梯度，用LAMP檢測試劑盒進行檢測，結果第1到第4個梯度的稀釋液為陽性，其余梯度都為陰性（表2）。結核桿菌H37Rv基因組DNA原液經(jīng)紫外分光光度計定量為58ng／ml，從Genbank查結核桿菌基因組大約為4.41Mbp，最后計算得出每個lamp反應體系最低檢出限為12個拷貝。

表4 結核桿菌H37Rv基因組DNA稀釋液lamp方法檢測結果a

3 討論

從LAMP技術的原理和以上檢測結果來看，LAMP方法的靈敏度同現(xiàn)在廣泛應用的PCR方法一致，能完全滿足目前結核分枝桿菌檢測的需要。每個lamp反應體系最低檢出限可達到12個拷貝，這一點要優(yōu)于PCR方法。結核分枝桿菌（LAMP法）基因快速檢測試劑盒的目標菌株為結核分枝桿菌復合群，而我們的檢測結果中潰瘍分枝桿菌（M.ulcerans）、鳥分枝桿菌（M.avium）、恥垢分枝桿菌（M.smegmatis）、副偶發(fā)分枝桿菌（M.parofortuitum）和不產(chǎn)色分枝桿菌（M.nonchromogenicum）都不屬于結核分枝桿菌復合群的菌株也為陽性。這些實驗結果說明，LAMP檢測試劑盒可穩(wěn)定檢出目標菌，但部分非目標菌存在不確定的干擾。該方法對非目標菌存在的不確定干擾從序列上分析是不存在的。我 們.LAMP 的 外 引.（F3：GGGTACGAGTGGTCTCAGG，B3：CGTCTTGGGTCACCCTCT）作為上下游引物，常規(guī)PCR擴增目的片段。結果發(fā)現(xiàn)，實驗結果與培養(yǎng)和16SrRNA測序所得的結果一致。據(jù)此可確定，潰瘍分枝桿菌（M.ulcerans）等5株菌的檢測結果為假陽性。

假陽性的產(chǎn)生有很多原因，國內也有類似文獻報道［4]。因北京結研所和華南理工大學的實驗室都要常規(guī)進行分子生物學實驗，DNA交叉污染的可能性較大，故推測影響本實驗特異性結果的因素很可能為模板的污染問題。實驗者可以通過規(guī)范的操作和特殊處理來減少污染的機會，比如隔離混合反應液和檢測結果的房間，經(jīng)常進行實驗工具和實驗臺的清洗，和加入dUTP偶聯(lián)尿嘧啶－N－糖苷酶（UDG）來防止擴增產(chǎn)物的污染［5]。

目前的LAMP技術具有很多優(yōu)點：（1）恒溫擴增，不需特殊試劑，不需預先雙鏈DNA變性。（2）高特異性：應用6個區(qū)段，4種引物進行擴增。（3）快速、高效擴增：整個擴增在1h內即可完成，且產(chǎn)率可達到0.5mg／ml。使用環(huán)狀引物可以在現(xiàn)有的基礎上縮短1／3～1／2的時間［6]。（4）不需要昂貴的儀器設備，檢測方法簡單，結果判定直接。該方法的特點和優(yōu)勢可以使之在基層實驗室及現(xiàn)場監(jiān)測方面廣泛使用，在快速檢測方面具有光明的應用前景。因此自LAMP技術發(fā)明以來，其被廣泛的應用于病原體基因檢測等領域［7－9]。國外的結核分枝桿菌LAMP快速檢測試劑試用結果表明［10－11]，該方法對痰涂片和痰培養(yǎng)都陽性標本的檢測靈敏度為97.7%；而對于涂片陰性但培養(yǎng)陽性標本的靈敏度為48.8%；對培養(yǎng)陰性的標本特異性為99.0%。目前，國外此類LAMP快速檢測試劑尚未在國內銷售，而且觀察實驗結果需要價格高昂的配套設備，不適于在廣大基層實驗室開展。為此，我們開發(fā)了具有自主版權的LAMP引物設計軟件，提高了設計效率和引物成功率。而且通過LAMP反應管的專利設計，徹底解決了“氣溶膠”干擾，實現(xiàn)核酸擴增后不開蓋判讀檢測結果，有效避免了交叉污染。

因為該方法主要應用于基層實驗室的結核桿菌診斷，所以適用性是關系到該技術能否被廣大基層醫(yī)務工作者接受的關鍵因素之一。從目前試用情況來看，我們建立的結核分枝桿菌LAMP快速檢測方法將操作者的操作步驟降到最少，交叉污染的可能性也降到了很低水平，而且具有所需設備簡單、操作容易、價格低廉等優(yōu)勢。因此，LAMP技術的應用，將會大幅度提高結核病患者的發(fā)現(xiàn)率，并將對我國結核病控制工作的順利進行提供有力的保障。

［1] NotomiT，OkayamaH，MasubuchiH，YonekawaT，WatanabeK，Amino N，Hase T.Loop－mediated isothermal amplification of DNA［J] .Nucleic Acids Ices，2000，28（12）：E63.

［2] MoriY，Nagamine K，Tamita N，Notomi T.Detection of loop－mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation［J] .Biochem Biophys Res Commun，2001，289（1）：150－154.

［3] IwamotoT，Sonobe T，Hayashi K.Loop－mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex，M.aviumand M.int racel lulare in sputum samples［J] .J Clin Microbiol，2003，41（6）：2616－2622.

［4] 黃帆，李琳，林世平，梅國華，山崎伸二，石磊.DNA環(huán)介導恒溫擴增技術速檢測結核分枝桿菌的研究［J] .現(xiàn)代食品科技，2008，24（8）：835－838.

［5] Hellyer TJ，DesJardin LE，Assaf MK，Bates JH，Cave MD，Eisenach KD.Specificity of IS6110－Based Amplification Assays for Mycobacterium tuberculosis Complex［J] .J Clin Microbiol，1996，34（11）：2843－2846.

［6] Nagamine K，Hase T，Notomi T.Accelerated reaction by loopmediated isothermal amplification using loop primers［J] .Molecular and Cellular Probes，2002，16：223－229.

［7] Poon LL，Leung CS，Chan KH，Lee JH，Yuen KY，Guan Y，Peiris JS.Detection of human influenza A viruses by loop－mediated isothermal amplification［J] .J Clin Microbiol，2005，43（1）：427－430.

［8] Imai M，Ninomiya A，Minekawa H，Notomi T，Ishizaki T，Tashiro M，Odagiri T.Development of H5RT－LAMP（loopmediated isothermal amplifiction）system for rapid diagnosis of H5avian influenza virus infection ［J] .Vaccine，2006，24（44）：6679－6682.

［9] Imai M，Ninomiya A，Minekawa H，Notomi T，Ishizaki T，Van Tu P，Tien NT，Tashiro M，Odagiri T.Rapid diagnosis of H5N1avian influenza virus infection by newly developed influenza H5hemagglutinin gene－specific loop－mediated isothermal amplification method［J] .J Virol Methods，2007，141（2）：173－180.

［10] 李啟明，侯云德.逆轉錄環(huán)介導等溫核酸擴增技術（RTLAMP）在H5N1禽流感病毒基因檢測中的應用［J] .病毒學報，2008，24（3）：178－207.

［11] Boehme CC，Nabeta P，Henostroza G，Raqib R，Rahim Z，Gerhardt M，Sanga E，Hoelscher M，Notomi T，Hase T，Perkins1MD.Operational feasibility of using loop－mediated isothermal amplification for diagnosis of pulmonary tuberculosis in microscopy centers of developing countries［J] .J Clin Microbiol，2007，45（6）：1936－1940.

［12] Pandey BD，Poudel A，Yoda T，Tamaru A，Oda N，F(xiàn)ukushima Y，Lekhak B，Risal B，Acharya B，Sapkota B，Nakajima C，Taniguchi T，Phetsuksiri B，Suzuki Y.Development of an inhouse loop－mediated isothermal amplification（LAMP）assay for detection of Mycobacteriumtuberculosisand evaluation in sputum samples of Nepalesepatients［J] .J Med Microbiol，2008，57：439－443.