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    結(jié)核分枝桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增(LAMP)快速檢測方法的評價

    2011-09-20 09:58:30戴廣明曹以誠杜正平陳洵黃曙海逄宇周楊黃海榮趙雁林
    中國防癆雜志 2011年1期
    關(guān)鍵詞:檢測

    戴廣明 曹以誠 杜正平 陳洵 黃曙海 逄宇 周楊 黃海榮 趙雁林

    (1.北京結(jié)核病胸部腫瘤研究所 北京 101149;2.華南理工大學(xué) 廣州 510640;3.廣西疾病預(yù)防控制中心 南寧 530000)

    細(xì)菌學(xué)檢查是發(fā)現(xiàn)結(jié)核病傳染源的主要途徑和手段,是確定結(jié)核病診斷和化療方案的重要依據(jù)。但由于敏感性低或所需時間過長等原因,致使結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢查一直不能滿足臨床診治的需求,存在延誤診斷和誤診情況,同時也耽誤了患者得到及時治療的時間,影響了治療效果,也使得疾病的傳播難于控制。因此,缺乏早期、準(zhǔn)確和廉價的診斷技術(shù)是制約全球結(jié)核病控制的嚴(yán)重障礙。

    近年發(fā)展起來的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP),完全突破了傳統(tǒng)分子生物學(xué)檢測技術(shù)需要昂貴儀器設(shè)備以及繁雜操作的限制,給分子生物學(xué)診斷技術(shù)的廉價普及帶來了希望。該方法最初是由Notomi等[1]設(shè)計來用于病原微生物的檢測,技術(shù)的工作原理是利用4條不同的特異性引物識別靶基因的6個特定區(qū)段,在等溫條件下進(jìn)行擴增反應(yīng)。基因的擴增和產(chǎn)物的檢測可一步完成,擴增效率高,可在15~60min擴增109~1010倍。所有靶基因序列的檢測可只通過擴增產(chǎn)物的有、無來判別。結(jié)果的判斷很簡單,主要有以下兩種方式:(1)反應(yīng)結(jié)束后直接在紫外燈光下判讀有無擴增反應(yīng)產(chǎn)物形成;(2)核酸大量合成時,從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合,產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀,應(yīng)用濁度儀檢測沉淀濁度來判定[2]。由于方法簡單易行,即使是沒有分子生物學(xué)實驗經(jīng)驗的技術(shù)人員也只需1周的訓(xùn)練就可掌握。

    本文對國內(nèi)建立的結(jié)核分枝桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增(LAMP)快速檢測方法進(jìn)行了介紹和評價,結(jié)果如下。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種 本室保存的31株分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株,48株臨床結(jié)核分枝桿菌。

    1.1.2 結(jié)核分枝桿菌(LAMP法)基因快速檢測試劑盒(以下簡稱LAMP檢測試劑盒)由我們和華南理工大學(xué)共同研發(fā),基因組DNA純化試劑盒(Genomic DNA Purification Kit)購自Promega公司。

    1.2 方法

    1.2.1 檢測目標(biāo)菌株和靶標(biāo)引物 結(jié)核分枝桿菌基因快速檢測方法的目標(biāo)菌株確定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群,包括結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium bovis)、非洲結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium africanum)和田鼠結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium microti)。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道[3]和預(yù)實驗,靶標(biāo)確定為編碼DNA解旋酶B亞基的gyrB基因,通過序列分析獲得保守區(qū)域設(shè)計引物(圖1),內(nèi)引物為FIP和BIP,外引物為F3和B3(引物設(shè)計軟件為華南理工大學(xué)開發(fā)的LAMP引物設(shè)計專用軟件)。引物序列為FIP:ACCGTTGACCCCGTCTTCTTGttttAGAAGTCGGAACCCCT 和 BIP:ATACGACTTCGAAACCGTCGCCttttGGTCAGCCCCTTGTTGAG, F3: GGGTACGAGTGGTCTCAGG,B3:CGTCTTGGGTCACCCTCT。

    1.2.2 DNA模板制備 取對數(shù)生長期的分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床結(jié)核分枝桿菌,用滅菌蒸餾水分別懸浮于1.5ml離心管中高溫滅菌后,8000r/min離心5min,取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中作為粗制模板DNA?;?qū)⑸锨逡汉图?xì)胞沉淀用基因組DNA純化試劑盒(Genomic DNA Purification Kit)提取基因組DNA作為精制的模板DNA。

    圖1 目標(biāo)菌gyrB基因序列高度一致的保守區(qū)域(紅框中是引物識別靶基因的6個特定區(qū)段)

    圖2 LAMP反應(yīng)結(jié)果(綠色的是有發(fā)生特異性擴增的陽性管,橙色的為陰性管)

    1.2.3 LAMP擴增反應(yīng) 結(jié)核分枝桿菌(LAMP法)基因快速檢測試劑盒包括20支LAMP反應(yīng)管和陽性標(biāo)準(zhǔn)管、陰性標(biāo)準(zhǔn)管各1支。每支LAMP反應(yīng)管為1個LAMP反應(yīng)體系,分為大小2個腔。大腔含有1.6μmol/L FIP引物、1.6μmol/L BIP 引物、0.4μmol/L F3 引 物、0.4μmol/L B3 引 物、1mol/L Betaine溶液、6mmol/L MgSO4溶液、8U Bst DNA 聚合酶、1.6mmol/L dNTP溶液、2.5μL 10×Thermo Pol Buffer,小腔含2μL核酸染料,最后上面覆蓋一層石蠟油(25μL)以防止污染。陽性標(biāo)準(zhǔn)為卡介苗核酸溶液,陰性標(biāo)準(zhǔn)為樣品處理液。將粗制模板DNA 2.5μL或精制模板DNA 1μL加入LAMP反應(yīng)管的大腔底部,置65℃恒溫反應(yīng)60min即可。每次反應(yīng)都應(yīng)加陰性標(biāo)準(zhǔn)模版、陽性標(biāo)準(zhǔn)模版作為對照。

    1.2.3 PCR擴增反應(yīng) 在50μl PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴增反應(yīng),含有10×緩沖液5μl,上下游引物各 0.1μM (F3:GGGTACGAGTGGTCTCAGG,B3: CGTCTTGGGTCACCCTCT ), 0.2mM dNTP,2μM MgCl2,1.5UTaq DNA 聚合酶及100ngDNA模板。在PE-9700擴增儀上94℃預(yù)變性5min后,進(jìn)行30次下述循環(huán):94℃1min,58℃1min和72℃1min,72℃延伸7min。最后取5μl PCR擴增產(chǎn)物,在1.5%瓊脂糖凝膠(其中含40μl/ml溴乙錠)中進(jìn)行電泳,時間為1h。電泳完畢,用讀膠儀拍照,并用標(biāo)準(zhǔn)DNA 1 500bp ladder進(jìn)行帶型大小比較結(jié)果判定。

    1.2.4 結(jié)核桿菌H37Rv基因組DNA稀釋實驗取結(jié)核桿菌H37Rv培養(yǎng)物作為原液,用滅菌蒸餾水懸浮于1.5ml離心管,高溫滅菌后,用純化試劑盒(Genomic DNA Purification Kit)提取基因組DNA作為底液作10倍梯度稀釋,共稀釋10個梯度。然后以其做模版進(jìn)行l(wèi)amp檢測。

    1.2.5 重復(fù)對照實驗 分別由本室實驗員和華南理工大學(xué)實驗員對相同的樣品進(jìn)行重復(fù)對照測試。

    1.2.6 結(jié)果判斷 取出反應(yīng)管,冷卻至室溫,顛倒LAMP反應(yīng)管,使大小腔反應(yīng)物混勻。其結(jié)果可以通過肉眼觀察到的顏色變化來判斷,顏色立即變綠的是有發(fā)生特異性擴增的陽性管,變橙色的為陰性管。若陰陽性對照反應(yīng)管結(jié)果與上述情況不符,則本次檢測結(jié)果無效,應(yīng)重新檢測。

    2 結(jié)果

    2.1 LAMP反應(yīng)的靈敏度和特異性試驗 取本室保存分枝桿菌31株標(biāo)準(zhǔn)菌株和48株臨床結(jié)核分枝桿菌的DNA模板進(jìn)行LAMP反應(yīng),結(jié)果如表1和圖2所示。從圖2可以看到,顏色立即變綠的是發(fā)生特異性擴增的陽性管,變橙色的為陰性管。在相同反應(yīng)條件下,LAMP方法能迅速的檢測出結(jié)核桿菌復(fù)合群,包括結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)、非洲分枝桿菌(Mycobacterium africanum)和田鼠分枝桿菌(Mycobacterium microti)。華南理工大學(xué)的檢測結(jié)果為56株菌為陽性,23株菌為陰性,其中潰瘍分枝桿菌(M.ulcerans)和鳥分枝桿菌(M.avium)不屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的菌株也為陽性。以實驗菌株培養(yǎng)和16SrRNA測序結(jié)果作為金標(biāo),從表2可計算得出特異度為92.0%,靈敏度為100.0%。北京結(jié)研所的檢測結(jié)果為57株菌為陽性,22株菌為陰性,其中恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)、副偶發(fā)分枝桿菌(M.parofortuitum)和不產(chǎn)色分枝桿菌(M.nonchromogenicum)不屬于結(jié)核桿菌復(fù)合群的菌株也為陽性。從表3可計算得出特異度為88.0%,靈敏度為100.0%。PCR擴增和金標(biāo)的結(jié)果相同,都是54株菌為陽性,25株菌為陰性。

    表1 實驗菌株P(guān)CR擴增和LAMP檢測結(jié)果

    表2 華南理工大學(xué)LAMP檢測結(jié)果a

    表3 北京結(jié)研所檢測結(jié)果a

    2.1 LAMP反應(yīng)最低檢出限的計算 將結(jié)核桿菌H37Rv提取基因組DNA并稀釋10個梯度,用LAMP檢測試劑盒進(jìn)行檢測,結(jié)果第1到第4個梯度的稀釋液為陽性,其余梯度都為陰性(表2)。結(jié)核桿菌H37Rv基因組DNA原液經(jīng)紫外分光光度計定量為58ng/ml,從Genbank查結(jié)核桿菌基因組大約為4.41Mbp,最后計算得出每個lamp反應(yīng)體系最低檢出限為12個拷貝。

    表4 結(jié)核桿菌H37Rv基因組DNA稀釋液lamp方法檢測結(jié)果a

    3 討論

    從LAMP技術(shù)的原理和以上檢測結(jié)果來看,LAMP方法的靈敏度同現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的PCR方法一致,能完全滿足目前結(jié)核分枝桿菌檢測的需要。每個lamp反應(yīng)體系最低檢出限可達(dá)到12個拷貝,這一點要優(yōu)于PCR方法。結(jié)核分枝桿菌(LAMP法)基因快速檢測試劑盒的目標(biāo)菌株為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群,而我們的檢測結(jié)果中潰瘍分枝桿菌(M.ulcerans)、鳥分枝桿菌(M.avium)、恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)、副偶發(fā)分枝桿菌(M.parofortuitum)和不產(chǎn)色分枝桿菌(M.nonchromogenicum)都不屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的菌株也為陽性。這些實驗結(jié)果說明,LAMP檢測試劑盒可穩(wěn)定檢出目標(biāo)菌,但部分非目標(biāo)菌存在不確定的干擾。該方法對非目標(biāo)菌存在的不確定干擾從序列上分析是不存在的。我 們.LAMP 的 外 引.(F3:GGGTACGAGTGGTCTCAGG,B3:CGTCTTGGGTCACCCTCT)作為上下游引物,常規(guī)PCR擴增目的片段。結(jié)果發(fā)現(xiàn),實驗結(jié)果與培養(yǎng)和16SrRNA測序所得的結(jié)果一致。據(jù)此可確定,潰瘍分枝桿菌(M.ulcerans)等5株菌的檢測結(jié)果為假陽性。

    假陽性的產(chǎn)生有很多原因,國內(nèi)也有類似文獻(xiàn)報道[4]。因北京結(jié)研所和華南理工大學(xué)的實驗室都要常規(guī)進(jìn)行分子生物學(xué)實驗,DNA交叉污染的可能性較大,故推測影響本實驗特異性結(jié)果的因素很可能為模板的污染問題。實驗者可以通過規(guī)范的操作和特殊處理來減少污染的機會,比如隔離混合反應(yīng)液和檢測結(jié)果的房間,經(jīng)常進(jìn)行實驗工具和實驗臺的清洗,和加入dUTP偶聯(lián)尿嘧啶-N-糖苷酶(UDG)來防止擴增產(chǎn)物的污染[5]。

    目前的LAMP技術(shù)具有很多優(yōu)點:(1)恒溫擴增,不需特殊試劑,不需預(yù)先雙鏈DNA變性。(2)高特異性:應(yīng)用6個區(qū)段,4種引物進(jìn)行擴增。(3)快速、高效擴增:整個擴增在1h內(nèi)即可完成,且產(chǎn)率可達(dá)到0.5mg/ml。使用環(huán)狀引物可以在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上縮短1/3~1/2的時間[6]。(4)不需要昂貴的儀器設(shè)備,檢測方法簡單,結(jié)果判定直接。該方法的特點和優(yōu)勢可以使之在基層實驗室及現(xiàn)場監(jiān)測方面廣泛使用,在快速檢測方面具有光明的應(yīng)用前景。因此自LAMP技術(shù)發(fā)明以來,其被廣泛的應(yīng)用于病原體基因檢測等領(lǐng)域[7-9]。國外的結(jié)核分枝桿菌LAMP快速檢測試劑試用結(jié)果表明[10-11],該方法對痰涂片和痰培養(yǎng)都陽性標(biāo)本的檢測靈敏度為97.7%;而對于涂片陰性但培養(yǎng)陽性標(biāo)本的靈敏度為48.8%;對培養(yǎng)陰性的標(biāo)本特異性為99.0%。目前,國外此類LAMP快速檢測試劑尚未在國內(nèi)銷售,而且觀察實驗結(jié)果需要價格高昂的配套設(shè)備,不適于在廣大基層實驗室開展。為此,我們開發(fā)了具有自主版權(quán)的LAMP引物設(shè)計軟件,提高了設(shè)計效率和引物成功率。而且通過LAMP反應(yīng)管的專利設(shè)計,徹底解決了“氣溶膠”干擾,實現(xiàn)核酸擴增后不開蓋判讀檢測結(jié)果,有效避免了交叉污染。

    因為該方法主要應(yīng)用于基層實驗室的結(jié)核桿菌診斷,所以適用性是關(guān)系到該技術(shù)能否被廣大基層醫(yī)務(wù)工作者接受的關(guān)鍵因素之一。從目前試用情況來看,我們建立的結(jié)核分枝桿菌LAMP快速檢測方法將操作者的操作步驟降到最少,交叉污染的可能性也降到了很低水平,而且具有所需設(shè)備簡單、操作容易、價格低廉等優(yōu)勢。因此,LAMP技術(shù)的應(yīng)用,將會大幅度提高結(jié)核病患者的發(fā)現(xiàn)率,并將對我國結(jié)核病控制工作的順利進(jìn)行提供有力的保障。

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