• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    結(jié)核分枝桿菌環(huán)介導恒溫擴增(LAMP)快速檢測方法的評價

    2011-09-20 09:58:30戴廣明曹以誠杜正平陳洵黃曙海逄宇周楊黃海榮趙雁林
    中國防癆雜志 2011年1期
    關(guān)鍵詞:檢測

    戴廣明 曹以誠 杜正平 陳洵 黃曙海 逄宇 周楊 黃海榮 趙雁林

    (1.北京結(jié)核病胸部腫瘤研究所 北京 101149;2.華南理工大學 廣州 510640;3.廣西疾病預防控制中心 南寧 530000)

    細菌學檢查是發(fā)現(xiàn)結(jié)核病傳染源的主要途徑和手段,是確定結(jié)核病診斷和化療方案的重要依據(jù)。但由于敏感性低或所需時間過長等原因,致使結(jié)核病細菌學檢查一直不能滿足臨床診治的需求,存在延誤診斷和誤診情況,同時也耽誤了患者得到及時治療的時間,影響了治療效果,也使得疾病的傳播難于控制。因此,缺乏早期、準確和廉價的診斷技術(shù)是制約全球結(jié)核病控制的嚴重障礙。

    近年發(fā)展起來的環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(LAMP),完全突破了傳統(tǒng)分子生物學檢測技術(shù)需要昂貴儀器設(shè)備以及繁雜操作的限制,給分子生物學診斷技術(shù)的廉價普及帶來了希望。該方法最初是由Notomi等[1]設(shè)計來用于病原微生物的檢測,技術(shù)的工作原理是利用4條不同的特異性引物識別靶基因的6個特定區(qū)段,在等溫條件下進行擴增反應?;虻臄U增和產(chǎn)物的檢測可一步完成,擴增效率高,可在15~60min擴增109~1010倍。所有靶基因序列的檢測可只通過擴增產(chǎn)物的有、無來判別。結(jié)果的判斷很簡單,主要有以下兩種方式:(1)反應結(jié)束后直接在紫外燈光下判讀有無擴增反應產(chǎn)物形成;(2)核酸大量合成時,從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+結(jié)合,產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀,應用濁度儀檢測沉淀濁度來判定[2]。由于方法簡單易行,即使是沒有分子生物學實驗經(jīng)驗的技術(shù)人員也只需1周的訓練就可掌握。

    本文對國內(nèi)建立的結(jié)核分枝桿菌環(huán)介導恒溫擴增(LAMP)快速檢測方法進行了介紹和評價,結(jié)果如下。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種 本室保存的31株分枝桿菌標準菌株,48株臨床結(jié)核分枝桿菌。

    1.1.2 結(jié)核分枝桿菌(LAMP法)基因快速檢測試劑盒(以下簡稱LAMP檢測試劑盒)由我們和華南理工大學共同研發(fā),基因組DNA純化試劑盒(Genomic DNA Purification Kit)購自Promega公司。

    1.2 方法

    1.2.1 檢測目標菌株和靶標引物 結(jié)核分枝桿菌基因快速檢測方法的目標菌株確定為結(jié)核分枝桿菌復合群,包括結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium bovis)、非洲結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium africanum)和田鼠結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium microti)。根據(jù)相關(guān)文獻報道[3]和預實驗,靶標確定為編碼DNA解旋酶B亞基的gyrB基因,通過序列分析獲得保守區(qū)域設(shè)計引物(圖1),內(nèi)引物為FIP和BIP,外引物為F3和B3(引物設(shè)計軟件為華南理工大學開發(fā)的LAMP引物設(shè)計專用軟件)。引物序列為FIP:ACCGTTGACCCCGTCTTCTTGttttAGAAGTCGGAACCCCT 和 BIP:ATACGACTTCGAAACCGTCGCCttttGGTCAGCCCCTTGTTGAG, F3: GGGTACGAGTGGTCTCAGG,B3:CGTCTTGGGTCACCCTCT。

    1.2.2 DNA模板制備 取對數(shù)生長期的分枝桿菌標準菌株和臨床結(jié)核分枝桿菌,用滅菌蒸餾水分別懸浮于1.5ml離心管中高溫滅菌后,8000r/min離心5min,取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中作為粗制模板DNA?;?qū)⑸锨逡汉图毎恋碛没蚪MDNA純化試劑盒(Genomic DNA Purification Kit)提取基因組DNA作為精制的模板DNA。

    圖1 目標菌gyrB基因序列高度一致的保守區(qū)域(紅框中是引物識別靶基因的6個特定區(qū)段)

    圖2 LAMP反應結(jié)果(綠色的是有發(fā)生特異性擴增的陽性管,橙色的為陰性管)

    1.2.3 LAMP擴增反應 結(jié)核分枝桿菌(LAMP法)基因快速檢測試劑盒包括20支LAMP反應管和陽性標準管、陰性標準管各1支。每支LAMP反應管為1個LAMP反應體系,分為大小2個腔。大腔含有1.6μmol/L FIP引物、1.6μmol/L BIP 引物、0.4μmol/L F3 引 物、0.4μmol/L B3 引 物、1mol/L Betaine溶液、6mmol/L MgSO4溶液、8U Bst DNA 聚合酶、1.6mmol/L dNTP溶液、2.5μL 10×Thermo Pol Buffer,小腔含2μL核酸染料,最后上面覆蓋一層石蠟油(25μL)以防止污染。陽性標準為卡介苗核酸溶液,陰性標準為樣品處理液。將粗制模板DNA 2.5μL或精制模板DNA 1μL加入LAMP反應管的大腔底部,置65℃恒溫反應60min即可。每次反應都應加陰性標準模版、陽性標準模版作為對照。

    1.2.3 PCR擴增反應 在50μl PCR反應體系中進行擴增反應,含有10×緩沖液5μl,上下游引物各 0.1μM (F3:GGGTACGAGTGGTCTCAGG,B3: CGTCTTGGGTCACCCTCT ), 0.2mM dNTP,2μM MgCl2,1.5UTaq DNA 聚合酶及100ngDNA模板。在PE-9700擴增儀上94℃預變性5min后,進行30次下述循環(huán):94℃1min,58℃1min和72℃1min,72℃延伸7min。最后取5μl PCR擴增產(chǎn)物,在1.5%瓊脂糖凝膠(其中含40μl/ml溴乙錠)中進行電泳,時間為1h。電泳完畢,用讀膠儀拍照,并用標準DNA 1 500bp ladder進行帶型大小比較結(jié)果判定。

    1.2.4 結(jié)核桿菌H37Rv基因組DNA稀釋實驗取結(jié)核桿菌H37Rv培養(yǎng)物作為原液,用滅菌蒸餾水懸浮于1.5ml離心管,高溫滅菌后,用純化試劑盒(Genomic DNA Purification Kit)提取基因組DNA作為底液作10倍梯度稀釋,共稀釋10個梯度。然后以其做模版進行l(wèi)amp檢測。

    1.2.5 重復對照實驗 分別由本室實驗員和華南理工大學實驗員對相同的樣品進行重復對照測試。

    1.2.6 結(jié)果判斷 取出反應管,冷卻至室溫,顛倒LAMP反應管,使大小腔反應物混勻。其結(jié)果可以通過肉眼觀察到的顏色變化來判斷,顏色立即變綠的是有發(fā)生特異性擴增的陽性管,變橙色的為陰性管。若陰陽性對照反應管結(jié)果與上述情況不符,則本次檢測結(jié)果無效,應重新檢測。

    2 結(jié)果

    2.1 LAMP反應的靈敏度和特異性試驗 取本室保存分枝桿菌31株標準菌株和48株臨床結(jié)核分枝桿菌的DNA模板進行LAMP反應,結(jié)果如表1和圖2所示。從圖2可以看到,顏色立即變綠的是發(fā)生特異性擴增的陽性管,變橙色的為陰性管。在相同反應條件下,LAMP方法能迅速的檢測出結(jié)核桿菌復合群,包括結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)、非洲分枝桿菌(Mycobacterium africanum)和田鼠分枝桿菌(Mycobacterium microti)。華南理工大學的檢測結(jié)果為56株菌為陽性,23株菌為陰性,其中潰瘍分枝桿菌(M.ulcerans)和鳥分枝桿菌(M.avium)不屬于結(jié)核分枝桿菌復合群的菌株也為陽性。以實驗菌株培養(yǎng)和16SrRNA測序結(jié)果作為金標,從表2可計算得出特異度為92.0%,靈敏度為100.0%。北京結(jié)研所的檢測結(jié)果為57株菌為陽性,22株菌為陰性,其中恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)、副偶發(fā)分枝桿菌(M.parofortuitum)和不產(chǎn)色分枝桿菌(M.nonchromogenicum)不屬于結(jié)核桿菌復合群的菌株也為陽性。從表3可計算得出特異度為88.0%,靈敏度為100.0%。PCR擴增和金標的結(jié)果相同,都是54株菌為陽性,25株菌為陰性。

    表1 實驗菌株P(guān)CR擴增和LAMP檢測結(jié)果

    表2 華南理工大學LAMP檢測結(jié)果a

    表3 北京結(jié)研所檢測結(jié)果a

    2.1 LAMP反應最低檢出限的計算 將結(jié)核桿菌H37Rv提取基因組DNA并稀釋10個梯度,用LAMP檢測試劑盒進行檢測,結(jié)果第1到第4個梯度的稀釋液為陽性,其余梯度都為陰性(表2)。結(jié)核桿菌H37Rv基因組DNA原液經(jīng)紫外分光光度計定量為58ng/ml,從Genbank查結(jié)核桿菌基因組大約為4.41Mbp,最后計算得出每個lamp反應體系最低檢出限為12個拷貝。

    表4 結(jié)核桿菌H37Rv基因組DNA稀釋液lamp方法檢測結(jié)果a

    3 討論

    從LAMP技術(shù)的原理和以上檢測結(jié)果來看,LAMP方法的靈敏度同現(xiàn)在廣泛應用的PCR方法一致,能完全滿足目前結(jié)核分枝桿菌檢測的需要。每個lamp反應體系最低檢出限可達到12個拷貝,這一點要優(yōu)于PCR方法。結(jié)核分枝桿菌(LAMP法)基因快速檢測試劑盒的目標菌株為結(jié)核分枝桿菌復合群,而我們的檢測結(jié)果中潰瘍分枝桿菌(M.ulcerans)、鳥分枝桿菌(M.avium)、恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)、副偶發(fā)分枝桿菌(M.parofortuitum)和不產(chǎn)色分枝桿菌(M.nonchromogenicum)都不屬于結(jié)核分枝桿菌復合群的菌株也為陽性。這些實驗結(jié)果說明,LAMP檢測試劑盒可穩(wěn)定檢出目標菌,但部分非目標菌存在不確定的干擾。該方法對非目標菌存在的不確定干擾從序列上分析是不存在的。我 們.LAMP 的 外 引.(F3:GGGTACGAGTGGTCTCAGG,B3:CGTCTTGGGTCACCCTCT)作為上下游引物,常規(guī)PCR擴增目的片段。結(jié)果發(fā)現(xiàn),實驗結(jié)果與培養(yǎng)和16SrRNA測序所得的結(jié)果一致。據(jù)此可確定,潰瘍分枝桿菌(M.ulcerans)等5株菌的檢測結(jié)果為假陽性。

    假陽性的產(chǎn)生有很多原因,國內(nèi)也有類似文獻報道[4]。因北京結(jié)研所和華南理工大學的實驗室都要常規(guī)進行分子生物學實驗,DNA交叉污染的可能性較大,故推測影響本實驗特異性結(jié)果的因素很可能為模板的污染問題。實驗者可以通過規(guī)范的操作和特殊處理來減少污染的機會,比如隔離混合反應液和檢測結(jié)果的房間,經(jīng)常進行實驗工具和實驗臺的清洗,和加入dUTP偶聯(lián)尿嘧啶-N-糖苷酶(UDG)來防止擴增產(chǎn)物的污染[5]。

    目前的LAMP技術(shù)具有很多優(yōu)點:(1)恒溫擴增,不需特殊試劑,不需預先雙鏈DNA變性。(2)高特異性:應用6個區(qū)段,4種引物進行擴增。(3)快速、高效擴增:整個擴增在1h內(nèi)即可完成,且產(chǎn)率可達到0.5mg/ml。使用環(huán)狀引物可以在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上縮短1/3~1/2的時間[6]。(4)不需要昂貴的儀器設(shè)備,檢測方法簡單,結(jié)果判定直接。該方法的特點和優(yōu)勢可以使之在基層實驗室及現(xiàn)場監(jiān)測方面廣泛使用,在快速檢測方面具有光明的應用前景。因此自LAMP技術(shù)發(fā)明以來,其被廣泛的應用于病原體基因檢測等領(lǐng)域[7-9]。國外的結(jié)核分枝桿菌LAMP快速檢測試劑試用結(jié)果表明[10-11],該方法對痰涂片和痰培養(yǎng)都陽性標本的檢測靈敏度為97.7%;而對于涂片陰性但培養(yǎng)陽性標本的靈敏度為48.8%;對培養(yǎng)陰性的標本特異性為99.0%。目前,國外此類LAMP快速檢測試劑尚未在國內(nèi)銷售,而且觀察實驗結(jié)果需要價格高昂的配套設(shè)備,不適于在廣大基層實驗室開展。為此,我們開發(fā)了具有自主版權(quán)的LAMP引物設(shè)計軟件,提高了設(shè)計效率和引物成功率。而且通過LAMP反應管的專利設(shè)計,徹底解決了“氣溶膠”干擾,實現(xiàn)核酸擴增后不開蓋判讀檢測結(jié)果,有效避免了交叉污染。

    因為該方法主要應用于基層實驗室的結(jié)核桿菌診斷,所以適用性是關(guān)系到該技術(shù)能否被廣大基層醫(yī)務工作者接受的關(guān)鍵因素之一。從目前試用情況來看,我們建立的結(jié)核分枝桿菌LAMP快速檢測方法將操作者的操作步驟降到最少,交叉污染的可能性也降到了很低水平,而且具有所需設(shè)備簡單、操作容易、價格低廉等優(yōu)勢。因此,LAMP技術(shù)的應用,將會大幅度提高結(jié)核病患者的發(fā)現(xiàn)率,并將對我國結(jié)核病控制工作的順利進行提供有力的保障。

    [1] NotomiT,OkayamaH,MasubuchiH,YonekawaT,WatanabeK,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J] .Nucleic Acids Ices,2000,28(12):E63.

    [2] MoriY,Nagamine K,Tamita N,Notomi T.Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation[J] .Biochem Biophys Res Commun,2001,289(1):150-154.

    [3] IwamotoT,Sonobe T,Hayashi K.Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex,M.aviumand M.int racel lulare in sputum samples[J] .J Clin Microbiol,2003,41(6):2616-2622.

    [4] 黃帆,李琳,林世平,梅國華,山崎伸二,石磊.DNA環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)速檢測結(jié)核分枝桿菌的研究[J] .現(xiàn)代食品科技,2008,24(8):835-838.

    [5] Hellyer TJ,DesJardin LE,Assaf MK,Bates JH,Cave MD,Eisenach KD.Specificity of IS6110-Based Amplification Assays for Mycobacterium tuberculosis Complex[J] .J Clin Microbiol,1996,34(11):2843-2846.

    [6] Nagamine K,Hase T,Notomi T.Accelerated reaction by loopmediated isothermal amplification using loop primers[J] .Molecular and Cellular Probes,2002,16:223-229.

    [7] Poon LL,Leung CS,Chan KH,Lee JH,Yuen KY,Guan Y,Peiris JS.Detection of human influenza A viruses by loop-mediated isothermal amplification[J] .J Clin Microbiol,2005,43(1):427-430.

    [8] Imai M,Ninomiya A,Minekawa H,Notomi T,Ishizaki T,Tashiro M,Odagiri T.Development of H5RT-LAMP(loopmediated isothermal amplifiction)system for rapid diagnosis of H5avian influenza virus infection [J] .Vaccine,2006,24(44):6679-6682.

    [9] Imai M,Ninomiya A,Minekawa H,Notomi T,Ishizaki T,Van Tu P,Tien NT,Tashiro M,Odagiri T.Rapid diagnosis of H5N1avian influenza virus infection by newly developed influenza H5hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplification method[J] .J Virol Methods,2007,141(2):173-180.

    [10] 李啟明,侯云德.逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)(RTLAMP)在H5N1禽流感病毒基因檢測中的應用[J] .病毒學報,2008,24(3):178-207.

    [11] Boehme CC,Nabeta P,Henostroza G,Raqib R,Rahim Z,Gerhardt M,Sanga E,Hoelscher M,Notomi T,Hase T,Perkins1MD.Operational feasibility of using loop-mediated isothermal amplification for diagnosis of pulmonary tuberculosis in microscopy centers of developing countries[J] .J Clin Microbiol,2007,45(6):1936-1940.

    [12] Pandey BD,Poudel A,Yoda T,Tamaru A,Oda N,F(xiàn)ukushima Y,Lekhak B,Risal B,Acharya B,Sapkota B,Nakajima C,Taniguchi T,Phetsuksiri B,Suzuki Y.Development of an inhouse loop-mediated isothermal amplification(LAMP)assay for detection of Mycobacteriumtuberculosisand evaluation in sputum samples of Nepalesepatients[J] .J Med Microbiol,2008,57:439-443.

    猜你喜歡
    檢測
    QC 檢測
    “不等式”檢測題
    “一元一次不等式”檢測題
    “一元一次不等式組”檢測題
    “幾何圖形”檢測題
    “角”檢測題
    “有理數(shù)的乘除法”檢測題
    “有理數(shù)”檢測題
    “角”檢測題
    “幾何圖形”檢測題
    亚洲人成电影观看| 国产精品一区二区三区四区久久 | 一a级毛片在线观看| 波多野结衣高清无吗| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 午夜日韩欧美国产| 精品第一国产精品| 亚洲欧美激情综合另类| 性色av乱码一区二区三区2| 精品乱码久久久久久99久播| 久久久国产欧美日韩av| 久99久视频精品免费| 男人的好看免费观看在线视频 | 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 丝袜在线中文字幕| 热99国产精品久久久久久7| 99国产精品一区二区三区| 国产精品一区二区免费欧美| 91麻豆av在线| 一进一出抽搐动态| 国产亚洲精品久久久久5区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 在线观看免费视频日本深夜| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 色播在线永久视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 免费高清视频大片| 看免费av毛片| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 免费看十八禁软件| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲av电影在线进入| 亚洲久久久国产精品| 国产高清激情床上av| 悠悠久久av| 色播在线永久视频| 天堂影院成人在线观看| 99久久国产精品久久久| 国产亚洲精品久久久久5区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 91精品三级在线观看| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 91在线观看av| 精品国内亚洲2022精品成人| 性欧美人与动物交配| 99香蕉大伊视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产视频一区二区在线看| 国产精品国产高清国产av| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲avbb在线观看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| bbb黄色大片| 高清毛片免费观看视频网站 | 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲国产精品sss在线观看 | 天天影视国产精品| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 久久人人97超碰香蕉20202| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 村上凉子中文字幕在线| 国产成人欧美| 午夜视频精品福利| 精品福利观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 美女扒开内裤让男人捅视频| 很黄的视频免费| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 天堂中文最新版在线下载| 淫秽高清视频在线观看| 久久精品影院6| 黄色女人牲交| 一级a爱片免费观看的视频| 成人av一区二区三区在线看| 美女国产高潮福利片在线看| 国产99久久九九免费精品| 国产av一区在线观看免费| 精品久久蜜臀av无| 国产国语露脸激情在线看| 国产精品偷伦视频观看了| 久久亚洲真实| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲精品国产精品久久久不卡| av视频免费观看在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 欧美日韩亚洲高清精品| 97人妻天天添夜夜摸| 久久伊人香网站| 日韩大码丰满熟妇| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 久久久水蜜桃国产精品网| 亚洲精品粉嫩美女一区| 视频区欧美日本亚洲| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产成年人精品一区二区 | 99riav亚洲国产免费| 高清黄色对白视频在线免费看| 天堂中文最新版在线下载| 日本免费a在线| 国产亚洲精品久久久久5区| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 精品人妻1区二区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 麻豆久久精品国产亚洲av | 他把我摸到了高潮在线观看| 99re在线观看精品视频| 日本欧美视频一区| 男女下面进入的视频免费午夜 | 男女午夜视频在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 水蜜桃什么品种好| 国产精品一区二区精品视频观看| 午夜91福利影院| 真人做人爱边吃奶动态| 午夜日韩欧美国产| 亚洲专区字幕在线| 国产乱人伦免费视频| 在线观看66精品国产| 麻豆久久精品国产亚洲av | 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 成在线人永久免费视频| 亚洲av电影在线进入| 极品教师在线免费播放| 视频区欧美日本亚洲| 国产一区二区激情短视频| 亚洲av成人av| 国产一区二区在线av高清观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | aaaaa片日本免费| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久香蕉激情| 日本一区二区免费在线视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 中文欧美无线码| 一级,二级,三级黄色视频| 久久精品91无色码中文字幕| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲五月婷婷丁香| 在线看a的网站| 日本免费a在线| 日韩人妻精品一区2区三区| 久久精品成人免费网站| a级毛片在线看网站| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 午夜免费激情av| 中文字幕人妻熟女乱码| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久久影院123| 精品国产乱子伦一区二区三区| 麻豆一二三区av精品| 中文字幕高清在线视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 欧美性长视频在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 手机成人av网站| 一区二区三区激情视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲第一av免费看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产又爽黄色视频| 国产主播在线观看一区二区| 午夜免费观看网址| 大陆偷拍与自拍| 女警被强在线播放| 黑人猛操日本美女一级片| 男人的好看免费观看在线视频 | 国产极品粉嫩免费观看在线| 在线观看免费高清a一片| 黄色 视频免费看| 在线永久观看黄色视频| 老鸭窝网址在线观看| 精品久久蜜臀av无| 国产精品免费视频内射| 亚洲av成人av| 日韩高清综合在线| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲精品国产区一区二| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 午夜精品久久久久久毛片777| 9色porny在线观看| 国产97色在线日韩免费| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美日韩黄片免| 久久久久久久午夜电影 | 男女午夜视频在线观看| 色综合站精品国产| 中文字幕人妻丝袜制服| 最新在线观看一区二区三区| 欧美久久黑人一区二区| 久久久久国内视频| 亚洲第一青青草原| 69av精品久久久久久| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 在线观看免费视频日本深夜| 欧美一区二区精品小视频在线| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 另类亚洲欧美激情| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 一边摸一边做爽爽视频免费| 动漫黄色视频在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 黄色女人牲交| 五月开心婷婷网| а√天堂www在线а√下载| 午夜福利在线观看吧| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 久久草成人影院| 男女高潮啪啪啪动态图| 黄色毛片三级朝国网站| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产精品1区2区在线观看.| 国产一区二区三区视频了| 国产男靠女视频免费网站| 国产精品久久久人人做人人爽| 在线天堂中文资源库| 亚洲九九香蕉| 国产精品成人在线| 极品人妻少妇av视频| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲 欧美一区二区三区| 中文字幕精品免费在线观看视频| 久久婷婷成人综合色麻豆| 欧美在线黄色| 国产成人精品在线电影| 一夜夜www| 一区二区三区精品91| www国产在线视频色| 怎么达到女性高潮| 精品福利观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产一区在线观看成人免费| 国产一区二区激情短视频| 一级,二级,三级黄色视频| 一进一出抽搐动态| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久久久久久久久中文| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 成年人免费黄色播放视频| 天堂中文最新版在线下载| 91国产中文字幕| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产成人欧美在线观看| 亚洲专区字幕在线| 国产精品综合久久久久久久免费 | 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲五月色婷婷综合| 男女下面进入的视频免费午夜 | 精品久久久久久电影网| 黄色a级毛片大全视频| 美国免费a级毛片| 超碰97精品在线观看| 视频区图区小说| 国产精品一区二区免费欧美| 岛国在线观看网站| 精品电影一区二区在线| 欧美日本中文国产一区发布| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲欧美精品综合久久99| 久久久久久久久中文| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产xxxxx性猛交| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 美女福利国产在线| 国产精品综合久久久久久久免费 | 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 在线观看免费视频网站a站| 久久中文字幕人妻熟女| 一区二区三区精品91| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 一级片免费观看大全| 首页视频小说图片口味搜索| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 亚洲国产欧美一区二区综合| 最新在线观看一区二区三区| 免费在线观看日本一区| 亚洲五月色婷婷综合| 美女大奶头视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲精华国产精华精| e午夜精品久久久久久久| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产精品久久久av美女十八| 五月开心婷婷网| 99精品久久久久人妻精品| 精品国产乱子伦一区二区三区| 成年版毛片免费区| 国产成人系列免费观看| 久久精品影院6| 久久久久九九精品影院| 成人三级做爰电影| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产欧美日韩综合在线一区二区| 高清在线国产一区| 午夜日韩欧美国产| 欧美一区二区精品小视频在线| 欧美午夜高清在线| 精品福利永久在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲中文字幕日韩| 男人舔女人下体高潮全视频| 18禁美女被吸乳视频| 欧美中文日本在线观看视频| 精品福利观看| 国产在线观看jvid| 91成年电影在线观看| 亚洲五月婷婷丁香| 欧美黄色淫秽网站| av国产精品久久久久影院| 不卡av一区二区三区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产av一区二区精品久久| 黄频高清免费视频| 成人黄色视频免费在线看| 国产亚洲欧美精品永久| 国产激情欧美一区二区| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 波多野结衣高清无吗| 丰满的人妻完整版| av在线天堂中文字幕 | 久久久国产成人精品二区 | 午夜a级毛片| 91av网站免费观看| 久久香蕉激情| 美女扒开内裤让男人捅视频| 久久精品国产综合久久久| 欧美一区二区精品小视频在线| 99re在线观看精品视频| 极品教师在线免费播放| 99riav亚洲国产免费| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 纯流量卡能插随身wifi吗| 日韩欧美三级三区| 久久久久国内视频| 欧美一级毛片孕妇| 91精品国产国语对白视频| 国产99白浆流出| 黄片小视频在线播放| 国产成人影院久久av| 久久久久精品国产欧美久久久| 少妇粗大呻吟视频| 99在线人妻在线中文字幕| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 看片在线看免费视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 少妇被粗大的猛进出69影院| 久久精品91无色码中文字幕| 黄色怎么调成土黄色| 最好的美女福利视频网| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲av五月六月丁香网| 久热这里只有精品99| 母亲3免费完整高清在线观看| 精品日产1卡2卡| 精品久久久精品久久久| 精品国产一区二区三区四区第35| 老鸭窝网址在线观看| 日本三级黄在线观看| 一本综合久久免费| 日本 av在线| 久久精品影院6| 在线观看免费日韩欧美大片| 黄色怎么调成土黄色| 国产精品影院久久| 天天添夜夜摸| 老司机午夜福利在线观看视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 欧美最黄视频在线播放免费 | 91成人精品电影| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 精品免费久久久久久久清纯| 大码成人一级视频| 亚洲熟女毛片儿| 久久香蕉国产精品| 桃色一区二区三区在线观看| av免费在线观看网站| www.999成人在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 久久99一区二区三区| 丁香六月欧美| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲五月天丁香| 淫妇啪啪啪对白视频| 嫩草影视91久久| 最近最新中文字幕大全免费视频| 黑人猛操日本美女一级片| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 99国产精品免费福利视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 91在线观看av| 天天影视国产精品| 国产精品成人在线| 热re99久久国产66热| 国产又色又爽无遮挡免费看| 久久久久九九精品影院| 麻豆一二三区av精品| 村上凉子中文字幕在线| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 欧美最黄视频在线播放免费 | 久久久久久大精品| 中文字幕色久视频| 欧美成人午夜精品| 久久久久久大精品| 多毛熟女@视频| 日韩免费av在线播放| 久久久久久久精品吃奶| 欧美久久黑人一区二区| 韩国精品一区二区三区| 久久久国产精品麻豆| 最近最新免费中文字幕在线| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久九九热精品免费| netflix在线观看网站| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| av福利片在线| 99国产精品一区二区三区| 91精品三级在线观看| av片东京热男人的天堂| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 在线天堂中文资源库| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产一区二区三区视频了| 亚洲av第一区精品v没综合| 精品久久久久久久久久免费视频 | 亚洲精品国产精品久久久不卡| 午夜成年电影在线免费观看| 国产成人欧美| 男女下面插进去视频免费观看| 色尼玛亚洲综合影院| 日韩欧美国产一区二区入口| 在线观看午夜福利视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲免费av在线视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久精品国产亚洲av高清一级| 91在线观看av| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产精品一区二区在线不卡| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产成人精品无人区| 国产1区2区3区精品| 欧美午夜高清在线| 国产区一区二久久| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 日本a在线网址| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美在线黄色| 在线观看免费午夜福利视频| 九色亚洲精品在线播放| 露出奶头的视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 视频在线观看一区二区三区| 无限看片的www在线观看| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 乱人伦中国视频| 日韩大码丰满熟妇| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 老司机福利观看| 97碰自拍视频| 久久久久国内视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 12—13女人毛片做爰片一| 久久久久久久精品吃奶| 男男h啪啪无遮挡| 国产成年人精品一区二区 | 三上悠亚av全集在线观看| 免费看十八禁软件| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产精品日韩av在线免费观看 | 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲美女黄片视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产亚洲av高清不卡| 满18在线观看网站| 在线国产一区二区在线| 天堂动漫精品| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 丁香欧美五月| 午夜激情av网站| 女性生殖器流出的白浆| 精品第一国产精品| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产区一区二久久| 午夜精品国产一区二区电影| 国产成人影院久久av| 又黄又爽又免费观看的视频| 90打野战视频偷拍视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 男女下面进入的视频免费午夜 | 黄色毛片三级朝国网站| a级片在线免费高清观看视频| 国产精品久久电影中文字幕| 日本欧美视频一区| 女人精品久久久久毛片| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 热re99久久精品国产66热6| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲专区字幕在线| 90打野战视频偷拍视频| 色尼玛亚洲综合影院| 午夜影院日韩av| 国产极品粉嫩免费观看在线| 少妇粗大呻吟视频| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲三区欧美一区| 亚洲精华国产精华精| 亚洲国产精品合色在线| 久久久水蜜桃国产精品网| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产真人三级小视频在线观看| 国产亚洲欧美98| 男人舔女人的私密视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 日本黄色视频三级网站网址| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 欧美大码av| 国产av一区二区精品久久| 欧美中文综合在线视频| a级片在线免费高清观看视频| 免费在线观看日本一区| 91成年电影在线观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 丰满的人妻完整版| 淫妇啪啪啪对白视频| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲专区字幕在线| 久久亚洲真实| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产精华一区二区三区| 国产一区二区三区视频了| 成年人黄色毛片网站| 欧美日韩黄片免| 欧美色视频一区免费| 妹子高潮喷水视频| 一区二区三区精品91| 久久精品91蜜桃| 91国产中文字幕| 身体一侧抽搐| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 午夜视频精品福利| 亚洲人成电影免费在线| 国产高清视频在线播放一区| 99精品久久久久人妻精品| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 日本wwww免费看| 最好的美女福利视频网| 欧美黄色淫秽网站| 国产亚洲精品第一综合不卡| 操美女的视频在线观看| 亚洲少妇的诱惑av| 女人精品久久久久毛片| 久久国产乱子伦精品免费另类| 夜夜夜夜夜久久久久| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 免费人成视频x8x8入口观看| 国产精品国产高清国产av| 欧美成人性av电影在线观看| 99国产精品一区二区三区| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 日韩av在线大香蕉| av免费在线观看网站| 一级片免费观看大全| av免费在线观看网站| 在线观看午夜福利视频| 欧美成人午夜精品| 在线观看免费日韩欧美大片| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产精品综合久久久久久久免费 | 日韩欧美一区视频在线观看| 一级片'在线观看视频| 国产不卡一卡二| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 久久久国产一区二区| 美女午夜性视频免费| 国产亚洲欧美精品永久| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| www.精华液| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久影院123|