噬菌體生物擴(kuò)增法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌氧氟沙星耐藥性研究

王慶 徐東芳

（安徽省結(jié)核病防治研究所 合肥 230022）

耐多藥結(jié)核?。∕DR－TB）是新世紀(jì)結(jié)核病控制面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)之一［1]。對(duì)于耐多藥的治療需通過(guò)藥物敏感性實(shí)驗(yàn)選擇有效的藥物，氟喹諾酮類(lèi)藥物包括氧氟沙星（Ofloxacin，OFX）因其良好的抗結(jié)核活性，成為目前治療耐藥結(jié)核病廣泛應(yīng)用的二線(xiàn)藥物之一［2]。但常規(guī)耐藥性檢測(cè)方法時(shí)間太久，嚴(yán)重滯后臨床治療的需要。因此，快速準(zhǔn)確的氧氟沙星耐藥性檢測(cè)技術(shù)對(duì)臨床治療及控制結(jié)核病具有重要的意義。噬菌體生物擴(kuò)增法（phage amplified biologically assay，PhaB）是一種新型的表型技術(shù)，可快速診斷結(jié)核病和結(jié)核的藥物敏感性，一般不超過(guò)4d就得知藥敏結(jié)果，本文應(yīng)用噬菌體生物擴(kuò)增法對(duì)205株結(jié)核分枝桿菌氧氟沙星的耐藥性檢測(cè)，并與常規(guī)使用的絕對(duì)濃度法藥敏結(jié)果進(jìn)行比較，對(duì)不一致菌株進(jìn)行WHO推薦的比例法測(cè)定，以評(píng)價(jià)PhaB檢測(cè)結(jié)果的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 噬菌體及其檢測(cè)試劑 均為上海市肺科醫(yī)院結(jié)核病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，具體見(jiàn)文獻(xiàn)［3] 。

1.1.2 藥物及其濃度 OFX藥粉購(gòu)自Sigma公司，用0.4%NaOH溶解后，再用無(wú)菌蒸餾水配制為1mg／ml，－20℃保存，PhaB法應(yīng)用時(shí)稀釋至16μg／ml。

1.1.3.試 菌 株 H37Rv 標(biāo) 準(zhǔn) 菌 株 （ATCC 95054）購(gòu)自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病防治臨床中心國(guó)家菌種保藏中心，205株MTB臨床分離株均為本實(shí)驗(yàn)室?guī)齑婢辏縼?lái)自我院確診的肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本培養(yǎng)物，并經(jīng)常規(guī)生化反應(yīng)鑒定為MTB。檢測(cè)前，將待檢菌株轉(zhuǎn)種至改良羅氏培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)2～3周。檢測(cè)時(shí)，刮取菌落少許，磨菌后用液體培養(yǎng)基調(diào)整濁度至1個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?，相?dāng)于1mg／ml，1∶500稀釋后待檢。

1.2 方法

1.2.1 PhaB法 按相關(guān)參考文獻(xiàn)［4] 的方法進(jìn)行，但有以下不同。吸取1∶500稀釋的待檢菌液0.2ml，加入16μg／ml OFX 0.2ml（OFX終濃度為8μg／ml），對(duì)照管加0.2ml液體培養(yǎng)基，混勻后置37℃培養(yǎng)72h；各管加0.1ml噬菌體，37℃溫育1h；各管再加0.1ml殺毒劑（噬菌體滅活劑），充分混勻，室溫作用5min；各管混合物分別加入提前倒入平板的5ml液體培養(yǎng)基和1ml指示細(xì)胞混勻，加入5ml溶化的瓊脂（日本進(jìn)口分裝），旋轉(zhuǎn)混勻，37℃培養(yǎng)18～24h后觀(guān)察噬菌斑形成情況。分別計(jì)算每個(gè)菌株的加藥管與對(duì)照管的噬菌斑減少百分比。以加藥管與對(duì)照管的噬菌斑減少百分比≥90%判為敏感，反之為耐藥。每次實(shí)驗(yàn)均以H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株作為對(duì)照。

1.2.2 絕對(duì)濃度法和比例法測(cè)定OFX耐藥性按中國(guó)防癆協(xié)會(huì)制定的《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》［5]配制羅氏OFX藥敏培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)的絕對(duì)濃度法和比例法OFX耐藥性檢測(cè)，絕對(duì)濃度法藥物濃度分別為3、10μg／ml，比例法的藥物濃度為2μg／ml，每次實(shí)驗(yàn)均以H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株作為對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)方法學(xué)研究

2.1.1 藥物濃度和作用時(shí)間選擇 采用終濃度為1、4、8、16μg／ml系列梯度稀釋的OFX，分別與結(jié)核分枝桿菌OFX敏感株和耐藥株作用24、48和72h，然后進(jìn)行噬菌體檢測(cè)。結(jié)果表明在OFX終濃度為8μg／ml時(shí)，無(wú)論作用24、48和72h，耐藥株均出現(xiàn)大量噬菌斑；而敏感株作用24和48h均有噬菌斑，作用72h后無(wú)噬菌斑，因此選擇OFX終濃度為8μg／ml，藥物作用時(shí)間為72h。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 采用同樣的測(cè)定條件，1d內(nèi)對(duì)3株OFX耐藥株和3株敏感株檢測(cè)2次，連續(xù)5d，觀(guān)察測(cè)定方法的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，每次檢測(cè)敏感株均判斷為敏感，耐藥株均判斷為耐藥。此外，無(wú)藥對(duì)照管的噬菌斑數(shù)量基本相似。

2.2 臨床菌株的OFX耐藥性測(cè)定結(jié)果 采用PhaB法檢測(cè)205株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株OFX耐藥性，并與常規(guī)絕對(duì)濃度法藥敏結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表1。以絕對(duì)濃度法藥敏結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn)，則PhaB法測(cè)定OFX耐藥性的敏感性為95.4%（83／87），特異性為 93.2%（110／118），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為91.2%（83／91），陰性預(yù)測(cè)值為96.5%（110／114），準(zhǔn)確性為94.1%（193／205）。2種藥敏方法比較χ2＝0.75＜χ0.052＝3.84，顯示PhaB法與絕對(duì)濃度法測(cè)定OFX耐藥性結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 噬菌體法與絕對(duì)濃度法測(cè)定OFX耐藥性結(jié)果（株）

2.3 不一致菌株的氧氟沙星比例法測(cè)定 12株P(guān)haB法與絕對(duì)濃度法測(cè)定OFX耐藥性結(jié)果不一致的菌株，通過(guò)比例法耐藥性監(jiān)測(cè)，其中4株P(guān)haB法測(cè)定為OFX敏感而絕對(duì)濃度法測(cè)定為耐藥的菌株中，有3株（75%）比例法測(cè)定為敏感，1株（25%）比例法為耐藥，在8株P(guān)haB法測(cè)定為OFX耐藥而絕對(duì)濃度法敏感的菌株中，比例法測(cè)定耐藥6株（75%）、敏感2株（25%），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 噬菌體法與絕對(duì)濃度法測(cè)定OFX耐藥性不一致的菌株比例法結(jié)果 株

3 討論

分枝桿菌噬菌體在1947年首次分離，至今已分離出250余種［6]。近年來(lái)，分枝桿菌噬菌體在結(jié)核病快速診斷及耐藥性測(cè)定中的研究報(bào)道逐漸增多［7]。該方法的基本原理是分枝桿菌噬菌體能感染活的結(jié)核分枝桿菌，如待檢菌株為耐藥株，則可正常生長(zhǎng)，并被噬菌體感染，噬菌體在感染的菌體內(nèi)得到保護(hù)，不會(huì)被隨后加入的殺毒劑殺死（而敏感株因被藥物殺死，噬菌體無(wú)法進(jìn)入菌體內(nèi)，而被隨后加入的殺毒劑殺死）。噬菌體在感染的菌體內(nèi)大量繁殖，并將菌體裂解，釋放出的噬菌體可立即感染隨后加入的指示細(xì)胞，噬菌體使指示細(xì)胞裂解，在培養(yǎng)皿上出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的噬菌斑。因此，只要根據(jù)噬菌斑的有無(wú)即可判斷待檢菌株的耐藥性。

耐藥濃度的界定是要以已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法及臨床評(píng)估方法取得最高一致率的原則而確立的。在本研究中將OFX的耐藥臨界濃度界定為8μg／ml和作用時(shí)間為72h是通過(guò)預(yù)試驗(yàn)選定的，該耐藥臨界濃度檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性時(shí)與絕對(duì)濃度法取得最大一致性。國(guó)外關(guān)于PhaB法檢測(cè)氧氟沙星的相關(guān)報(bào)道較少，國(guó)內(nèi)楊華等［8]對(duì)氧氟沙星抗結(jié)核分枝桿菌的臨床耐藥界限的研究建議16μg／ml是較理想的耐藥臨界濃度，而我們采用了8μg／ml，可能原因是培養(yǎng)基不同，我們采用的是改良的羅氏培養(yǎng)基，而楊華等采用的是7H9液體培養(yǎng)基。本研究中，PhaB法對(duì)205株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行OFX藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，以絕對(duì)濃度法藥敏結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn)，敏感度為 95.4%（83／87），特異度為93.2%（110／118），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為91.2% （83／91），陰性 預(yù) 測(cè) 值.96.5% （110／114），總 符.率 為94.1%（193／205）。與國(guó)內(nèi)黃學(xué)銳等［9]的結(jié)果相比，較為一致。另外，對(duì)噬菌體法與絕對(duì)濃度法測(cè)定OFX耐藥性結(jié)果不符的12株菌株，我們采用了WHO／IUATLD全球結(jié)核病耐藥監(jiān)測(cè)項(xiàng)目推薦的比例法進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，該方法具有較高的穩(wěn)定性，可重復(fù)性高特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其中的9株噬菌體法檢測(cè)結(jié)果與比例法相符，符合率為75.0%（9／12），12株的噬菌體法與絕對(duì)濃度法結(jié)果不一致，矛盾出現(xiàn)的可能原因有：一是在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的亞培養(yǎng)株中耐藥株占的比例增高或者代謝活性的改變，對(duì)藥物己不敏感，造成假陽(yáng)性；二是絕對(duì)濃度法可能因方法上的缺陷如菌量接種誤差導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)，也可能是這兩種方法判定標(biāo)準(zhǔn)的不同導(dǎo)致的差異，標(biāo)準(zhǔn)的不同對(duì)結(jié)果影響很大，可能會(huì)得到相反的結(jié)論。且絕對(duì)濃度法目前雖然是我國(guó)推薦的常規(guī)藥敏方法，但OFX作為二線(xiàn)藥物，藥敏測(cè)定的濃度至今尚無(wú)參考依據(jù)，使羅氏藥敏測(cè)定OFX耐藥性存在不足，也會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。

綜上所述，噬菌體生物擴(kuò)增法測(cè)定OFX耐藥性確有較高的敏感性和特異性，不需要特殊儀器設(shè)備、經(jīng)濟(jì)安全等特點(diǎn)，有可能成為耐藥結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室快速診斷方法之一。但我們?cè)跈z測(cè)過(guò)程中體會(huì)到應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：（1）每次實(shí)驗(yàn)必須設(shè)全各種對(duì)照，如陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和殺毒劑對(duì)照等以保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性；（2）加入殺毒劑后一定要徹底搖勻，以殺死全部未進(jìn)入菌體里的噬菌體；（3）澆注平板時(shí)瓊脂的溫度為55℃，不宜過(guò)高，以免滅活噬菌體；（4）避免操作污染，以防影響結(jié)果觀(guān)察。

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