萬壽菊殺菌素Ⅰ抑菌作用及對西瓜幼苗的影響

范志宏，郭春絨，王金勝

（1.山西農(nóng)業(yè)大學文理學院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學生命科學院，山西太谷030801）

西瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌西瓜?；停‵usarium oxysporum f sp niveum，F(xiàn)ON）引起的毀滅性土傳病害，其在我國各西瓜產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，已成為影響西瓜生產(chǎn)最嚴重的病害之一[1-2]。目前,防治該病主要采用嫁接、化學農(nóng)藥熏蒸土壤、化學殺菌劑噴灌等，嫁接是最有效的方法，但生產(chǎn)成本較高。使用化學藥劑防治，對環(huán)境污染大，對牲畜有毒[3]。因此，研究和開發(fā)對西瓜枯萎病有效的新型殺菌劑具有重要的意義。而由于菊科植物萬壽菊（Tagetes patula）花、葉及根中含有具有特殊活性的化合物而受到特別的重視。國外有關于萬壽菊的化學成分和昆蟲活性[4]的報道。但是，對萬壽菊殺菌、抑菌活性方面的研究較少[3-5]。

本試驗采用菌碟法和田間試驗方法研究萬壽菊殺菌素Ⅰ對西瓜枯萎病病原菌的抑菌活性以及作用機理，以期為開發(fā)防治西瓜枯萎病的植物源新農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試西瓜品種 蘭州P2，感病品種。

1.1.2 供試菌株 西瓜枯萎病菌，辣椒枯萎病菌（Fusarium oxysporum），辣椒疫霉病菌（Phytophthpra capsici Len），均由山西農(nóng)業(yè)大學植物病理學系提供。將菌種接種到培養(yǎng)皿內(nèi)，25℃無光倒置，進行純化培養(yǎng)。

1.1.3 萬壽菊殺菌素Ⅰ 其為山西農(nóng)業(yè)大學萬壽菊殺菌素研究課題組合成。

1.1.4 西瓜枯萎病病原菌毒素粗提液 用理查德液體培養(yǎng)基，在25℃，100 r/min振蕩，3 000 lx光照條件下培養(yǎng)西瓜枯萎病菌，20 d后離心濾液（5 000 r/min，15 min），收集上清液即為西瓜枯萎病菌的毒素粗提液。鐮刀菌酸的定量以Sigma公司的鐮刀菌酸為標準，用標準加入法進行定量[5]。

1.2 方法

1.2.1 抑菌試驗 采用菌碟法：用打孔器從事先培養(yǎng)純化好的菌種中采菌，接種到含0.001，0.010，0.100，1.000 μg/mL萬壽菊殺菌素Ⅰ的PDA培養(yǎng)基上，并作空白對照（無藥劑的培養(yǎng)基），25℃恒溫培養(yǎng)，36，48 h后記錄菌絲生長直徑。重復3次，計算相對抑制率。

1.2.2 田間試驗 挑選飽滿的西瓜種子，分別用A溶液（含80%西瓜枯萎病菌毒素粗提液（鐮刀菌酸含量為4.005 5 μg/mL）和10 μg/mL萬壽菊殺菌素Ⅰ的混合液）、B溶液（含80%西瓜枯萎病菌毒素粗提液和5 μg/mL萬壽菊殺菌素Ⅰ的混合液）、C溶液（含80%西瓜枯萎病菌毒素粗提液）、CK（無菌水）浸種6 h，然后用無菌水沖洗干凈后用濕紗布包好種子，放1～2倍種子量的無菌沙子，在25℃左右黑暗催芽。當CK有50%～60%種子露白后播種于田間（氣溫25℃左右）。每處理重復3次。在第1片真葉完全展開時（苗期）作如下處理：處理A，A溶液浸種的西瓜苗再用含80%西瓜枯萎病菌毒素粗提液和10 μg/mL萬壽菊殺菌素Ⅰ的混合液灌根；處理B，B溶液浸種的西瓜苗再用80%西瓜枯萎病菌毒素粗提液和5 μg/mL萬壽菊殺菌素Ⅰ的混合液灌根；處理C，C溶液浸種的西瓜苗再用80%西瓜枯萎病菌毒素粗提液灌根；CK，無菌水浸種的西瓜苗再用無菌水灌根。每種處理使用相同藥劑液量（約10 mL/株），每處理2株，重復3次。

1.2.3 生理生化指標測定 對苗期的植株168 h內(nèi)分別測定如下指標：（1）CAT活性，采用Ti4+絡合法[5]測定；（2）SOD活性，采用 NBT光還原法[6]測定；（3）POD活性，采用愈創(chuàng)木酚法[6]測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度萬壽菊殺菌素Ⅰ對不同致病菌菌絲生長的影響

2.1.1 萬壽菊殺菌素Ⅰ對西瓜枯萎病菌菌絲生長的影響 萬壽菊殺菌素Ⅰ對西瓜枯萎病菌有明顯抑制作用（表1），在質(zhì)量濃度為0.010 μg/mL時，抑制效果不明顯，在達到0.100 μg/mL后，抑制效果顯著。與36 h的抑制率相比，48 h低質(zhì)量濃度的抑制率變化不大，而高質(zhì)量濃度的抑制率顯著下降。說明隨著質(zhì)量濃度的增高，萬壽菊殺菌素Ⅰ的抑菌作用增強；而隨著時間的延長，抑制作用降低。說明萬壽菊殺菌素Ⅰ對西瓜枯萎病菌的抑制既有時間效應又有質(zhì)量濃度效應。

表1 不同質(zhì)量濃度萬壽菊殺菌素Ⅰ對西瓜枯萎病菌的抑制率 %

2.1.2 萬壽菊殺菌素Ⅰ對辣椒疫霉病菌菌絲生長的影響 隨著藥劑質(zhì)量濃度的增大，萬壽菊殺菌素Ⅰ對辣椒疫霉病菌的抑制作用呈增大趨勢（表2），說明萬壽菊殺菌素I對于辣椒疫霉病菌有質(zhì)量濃度效應。但是隨著時間的推移，抑制作用降低，說明萬壽菊殺菌素Ⅰ對辣椒疫霉病菌的抑制作用具有時間效應和質(zhì)量濃度效應。

表2 不同質(zhì)量濃度萬壽菊殺菌素Ⅰ對辣椒疫霉病菌的抑制率 %

2.1.3 萬壽菊殺菌素Ⅰ對辣椒枯萎病菌菌絲生長的影響 對于辣椒枯萎病菌，萬壽菊殺菌素Ⅰ的抑制作用在質(zhì)量濃度最大時比較明顯（表3），在相對較低質(zhì)量濃度的藥劑處理下抑制作用變化不明顯。在藥劑質(zhì)量濃度達到0.100 μg/mL以后，對辣椒枯萎病菌的抑制作用明顯。隨著時間的推移，其抑制作用變化不明顯，說明在本試驗范圍內(nèi)萬壽菊殺菌素Ⅰ對于辣椒枯萎病菌的抑制作用有閾值效應。

2.2 萬壽菊殺菌素Ⅰ及毒素處理對西瓜幼苗的CAT，POD和SOD活性的影響

2.2.1 處理對CAT活性的影響 西瓜苗期過氧化氫酶（CAT）活性波動幅度較大（圖1）。圖1結(jié)果說明，在西瓜苗期，植物本身生長勢弱，自身抗性差，因而在毒素作用下，西瓜的CAT活性降低。當有萬壽菊殺菌素Ⅰ存在時（處理A、處理B），其CAT的活性提高，說明萬壽菊殺菌素Ⅰ可起到消除枯萎病菌毒素對西瓜的毒害作用，而且該作用隨萬壽菊殺菌素Ⅰ濃度增大而增大。

表3 不同質(zhì)量濃度萬壽菊殺菌素Ⅰ對辣椒枯萎病菌的抑制率 %

2.2.2 處理對POD活性的影響 在西瓜苗期POD酶明顯受到影響（圖2）。圖2結(jié)果說明，隨著西瓜的自然生長，POD活性趨于穩(wěn)定。經(jīng)過萬壽菊殺菌素Ⅰ加毒素處理的植株（處理A、處理B），POD活性始終高于對照，說明萬壽菊殺菌素Ⅰ可較長時間作用于植株，提高植株的抗病性。

2.2.3 處理對SOD活性的影響 當用毒素處理時（處理C），西瓜SOD活性下降；萬壽菊殺菌素Ⅰ加毒素的處理中（處理A、處理B），SOD活性高于對照，恢復到正常水平（圖3），說明萬壽菊殺菌素Ⅰ能提高SOD活性。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，萬壽菊殺菌素Ⅰ有較好的抑菌效果。通過在西瓜枯萎病的主要發(fā)病期苗期施用萬壽菊殺菌素Ⅰ，植株體內(nèi)生理生化指標有較大變化，表明萬壽菊殺菌素Ⅰ能有效減輕西瓜枯萎病菌對植株的毒害作用。

萬壽菊殺菌素Ⅰ不但可以抑制西瓜枯萎病菌，還可以促進植株生長。這可能與萬壽菊殺菌素Ⅰ一方面誘導了幼苗的抗性，另一方面與萬壽菊殺菌素Ⅰ對毒素有一定的鈍化作用有關。前人研究表明[7]，CAT，SOD和POD這3個酶與植物抗病有關。SOD，POD可減輕毒素對根系膜系統(tǒng)的破壞，減輕質(zhì)膜傷害的程度；POD能清除逆境下植株體內(nèi)產(chǎn)生的有害自由基；SOD專一清除O2-，并抑制毒性更強的·OH生成[8]；CAT可分解體內(nèi)的過氧化物，是細胞內(nèi)抗脂質(zhì)過氧化作用保護系統(tǒng)的主要成分之一[9]。本試驗中，萬壽菊殺菌素Ⅰ的施用提高了SOD，POD的活性，并可維持CAT活性，因此，萬壽菊殺菌素Ⅰ的施用能提高西瓜植株內(nèi)保護酶活性，降低膜脂過氧化作用，保護生物膜，有效地抑制了西瓜枯萎病菌的為害。

深入研究植物源抑菌劑的作用機理并設計完全新型化學結(jié)構(gòu)的先導化合物，是當前尋找新型、高效抑菌劑的主要途徑。萬壽菊根提取物中抑菌活性主成分的人工合成及其抑菌作用機理需要作進一步的研究探討。

本研究為新農(nóng)藥的開發(fā)和先導化合物的發(fā)現(xiàn)提供了試驗依據(jù)，同時也為開發(fā)新的防治西瓜枯萎病的植物源農(nóng)藥提供了一定的理論基礎。

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