串葉松香草組培快繁技術(shù)研究

史向遠(yuǎn)，王秀紅，田良才，張乃生

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究中心，山西太原030031；2.山西省生物研究所，山西太原030006；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山西太原030006）

串葉松香草（Silphium perfolialum L）是菊科（Compositae）松香草屬（Silphium）多年生宿根草本植物，原產(chǎn)于北美中部草原地帶，我國(guó)于1979年從朝鮮引進(jìn)[1-2]。其具有適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)、耐熱耐寒、耐鹽堿、產(chǎn)草量高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)[3-4]，是一種新型飼草綠肥作物。其粗蛋白含量高于優(yōu)良豆科牧草苜蓿和三葉草，青干草粉是多種家畜、家禽和魚配合飼料及蛋白質(zhì)補(bǔ)充飼料的重要成分。此外，串葉松香草也被用來作為水土保持、防風(fēng)固沙、退耕還草和生態(tài)環(huán)境建設(shè)的首選草種[5-6]。當(dāng)前，在生產(chǎn)上串葉松香草的主要繁殖方式有種子育苗移栽繁殖、分株移栽和切莖、切根溫床育苗繁殖，利用離體組織培養(yǎng)進(jìn)行快速繁殖的研究較少。

本試驗(yàn)對(duì)串葉松香草不同外植體的組織培養(yǎng)及移栽馴化過程進(jìn)行研究，旨在建立串葉松香草的組培快繁技術(shù)體系。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料取自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究中心牧草試驗(yàn)地。

1.2 方法

1.2.1 外植體的采集及處理 采集串葉松香草的嫩芽、新葉、葉柄，用洗潔精溶液浸泡20 min后，流水沖洗干凈；在超凈工作臺(tái)上用75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗2～3次；再轉(zhuǎn)入0.1%升汞溶液中滅菌5～7 min；用無菌水沖洗4～5次，無菌濾紙吸干水分，切成0.2 m2方塊，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每種外植體接種10瓶，每瓶26枚。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo) 采用2因素3水平的試驗(yàn)方法，即3種不同的外植體（嫩芽、新葉、葉柄）和3種激素濃度的誘導(dǎo)培養(yǎng)基Cy1（6-BA 2.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L），Cy2 （6-BA 2.0 mg/L+2，4-D 3.0 mg/L），Cy3 （6-BA 2.0 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L），以MS為基本培養(yǎng)基，添加3%的蔗糖和0.65%的瓊脂粉，pH值為5.8，重復(fù)3次。將接種后的材料置于26～28℃的培養(yǎng)室內(nèi)，以日光燈為光源，光照強(qiáng)度為1 500 lx，光照時(shí)間為12 h/d，培養(yǎng)室相對(duì)濕度70%～80%。

1.2.3 增殖培養(yǎng) 愈傷組織誘導(dǎo)成功后，采用5種激素濃度配比的增殖培養(yǎng)基即Cz1（6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L），Cz2（6-BA 1.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L），Cz3（6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L），Cz4（6-BA 2.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L），Cz5（6-BA 3.0 mg/L+IBA0.5 mg/L）。其他培養(yǎng)條件同1.2.2。

1.2.4 生根培養(yǎng) 分化出組培苗后，以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，采用3種激素濃度配比的生根培養(yǎng)基，即 Cs1（6-BA0.2 mg/L+IBA 1.0 mg/L），Cs2（6-BA 0.2 mg/L+IBA 1.5 mg/L），Cs3（6-BA 0.2 mg/L+IBA 2.0 mg/L），添加1.5%的蔗糖和0.65%的瓊脂粉，pH值為5.8，重復(fù)3次。生根培養(yǎng)溫度為（20±2）℃。其他培養(yǎng)條件同1.2.2。

1.2.5 煉苗及移栽 組培苗生根后，當(dāng)苗長(zhǎng)至約5 cm、根系長(zhǎng)約5 cm時(shí)，煉苗2～3 d，移栽至裝有基質(zhì)（V（泥炭）∶V（珍珠巖）∶V（蛭石）=1∶1∶1）的培養(yǎng)缽內(nèi)，煉苗1個(gè)月后即可移入大田。1.2.6 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用DPS軟件[7]和Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素濃度對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效果

將3種外植體接種于Cy1，Cy2，Cy3這3種培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，經(jīng)15～20 d，從外植體切口處長(zhǎng)出淺黃色的顆粒狀愈傷組織，愈傷誘導(dǎo)情況列于表1。經(jīng)方差分析和Duncan’S多重比較結(jié)果表明，3種培養(yǎng)基之間差異呈極顯著水平，Cy2誘導(dǎo)率最高，平均愈傷組織誘導(dǎo)率在85%以上，為最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基。研究發(fā)現(xiàn)，添加2，4-D對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效果優(yōu)于添加IBA，可以判斷2，4-D在串葉松香草的愈傷誘導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。

表1 不同激素濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 不同外植體的愈傷組織誘導(dǎo)效果

不同外植體的膨大時(shí)間、愈傷形成和啟動(dòng)數(shù)量均有明顯差異，結(jié)果如圖1所示。

其中，嫩芽接種15 d便有黃綠色愈傷形成，大約30 d就長(zhǎng)到1 cm左右；葉柄需20 d形成愈傷；新葉則需26 d才可形成愈傷，且新葉和葉柄愈傷長(zhǎng)勢(shì)較慢，愈傷較?。▓D1）。

方差分析和Duncan’S多重比較結(jié)果表明，外植體間差異顯著（表2），嫩芽和葉柄的愈傷誘導(dǎo)效果要明顯好于新葉。綜合來看，不同外植體的愈傷形成能力大小依次為嫩芽＞葉柄＞新葉。

表2 不同外植體的愈傷組織誘導(dǎo)效果

2.3 不同激素對(duì)不定芽增殖分化的影響

愈傷組織膨大至1 cm時(shí)，切塊轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中。20 d左右，愈傷組織出現(xiàn)綠點(diǎn)，再轉(zhuǎn)1次分化培養(yǎng)基，綠點(diǎn)經(jīng)28 d分化為不定芽（圖2）。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，愈傷在Cz4和Cz5培養(yǎng)基上不定芽的分化效果較好。從表3可以看出，對(duì)不同培養(yǎng)基的不定芽增殖系數(shù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示，培養(yǎng)基間差異達(dá)到0.01的極顯著水平，說明6-BA濃度的變化對(duì)不定芽的增殖效果具有明顯的影響，且增殖系數(shù)隨著6-BA濃度的提高而提高，當(dāng)6-BA濃度達(dá)到一定的水平后，增殖系數(shù)變化差異變小。Duncan’S多重比較說明，Cz4和Cz5差異不顯著，而與其他培養(yǎng)基差異極顯著，說明6-BA和IBA的濃度配比對(duì)于增殖非常重要，并不是細(xì)胞分裂素濃度越高對(duì)分化越有利。此外，由于培養(yǎng)基中加入了生長(zhǎng)素的緣故，有部分不定芽長(zhǎng)出少量根系。綜合來看，Cz4為最適合的增殖培養(yǎng)基。

表3 不同增殖培養(yǎng)基的增殖效果

2.4 不同激素對(duì)生根培養(yǎng)的影響

將長(zhǎng)至5 cm左右的組培苗，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，接種10 d后就有白色突起出現(xiàn)，有根原基發(fā)生，20 d后幼苗生根率達(dá)60%以上（圖3）。

由表4，5可知，在不同激素配比的生根培養(yǎng)基中，Cs1培養(yǎng)基的根系生長(zhǎng)狀況一般，根數(shù)少，根系細(xì)長(zhǎng)；Cs2培養(yǎng)基的根系生長(zhǎng)較好，根數(shù)多且長(zhǎng)，根系較粗；Cs3培養(yǎng)基根系生長(zhǎng)良好，根系粗壯，長(zhǎng)度可達(dá)5.65 cm，根系生活力強(qiáng)。方差分析及Duncan’S多重比較結(jié)果表明，Cs3生根率與Cs2，Cs1之間差異極顯著，且Cs3的生根率最高，平均達(dá)到86.1%，其為最佳生根培養(yǎng)基配方。

表4 不同培養(yǎng)基的生根效果

表5 不同培養(yǎng)基條件下根系生長(zhǎng)狀況

2.5 生根苗的馴化及大田移栽

串葉松香草組培苗根系長(zhǎng)至5 cm左右時(shí)，即可轉(zhuǎn)入基質(zhì)進(jìn)行馴化培養(yǎng)。打開培養(yǎng)瓶蓋注入少量蒸餾水，放置2～3 d，再移栽至裝有基質(zhì)（V（泥炭）∶V（珍珠巖）∶V（蛭石）=1∶1∶1）的容器內(nèi)（圖4），移栽前對(duì)基質(zhì)消毒，并噴滅菌靈。

移栽時(shí)要注意根系務(wù)必沖洗干凈，以防霉菌污染，影響根系生長(zhǎng)，同時(shí)每天早晚各噴水1次，保持濕度。煉苗1個(gè)月后即可移入大田，移栽成活率達(dá)90%以上。

3 結(jié)論與討論

外源激素的添加濃度是影響植物組織培養(yǎng)效果的關(guān)鍵因素[8]。本研究獲得了串葉松香草組培快繁的最適培養(yǎng)基：愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基添加2.0 mg/L6-BA和3.0 mg/L2，4-D，增殖培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基添加2.5 mg/L 6-BA和0.5 mg/LIBA，生根培養(yǎng)基為1/2 MS基本培養(yǎng)基添加0.2 mg/L6-BA和2.0 mg/LIBA。

植物的不同組織和器官都有可能作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)誘導(dǎo)成苗，但培養(yǎng)效果卻存在很大差異[9-11]。李先芳等[12]以串葉松香草幼葉葉柄、子葉和胚軸作為外植體，通過誘導(dǎo)愈傷組織分化再生植株，獲得了組培苗并移栽成活。本研究利用嫩芽、新葉和葉柄進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，以嫩芽較易誘導(dǎo)出愈傷組織，且誘導(dǎo)率較高。

［1］王豪舉，呂壽英.串葉松香草栽培[M].北京：高等教育出版社，1993：12-21.

［2］廖云華，朱小彤.串葉松香草的飼用價(jià)值[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，1994（6）：49-51.

［3］吳健，任萍.串葉松香草在我國(guó)引種栽培中利用研究的現(xiàn)狀及展望[J].農(nóng)業(yè)情報(bào)研究，1993（3）：42-46.

［4］韓永芬，龍忠富，趙明坤.不同處理串葉松香草營(yíng)養(yǎng)成分的比較[J].中國(guó)草地，2000（5）：78-79.

［5］董寬虎.飼料生產(chǎn)學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003.

［6］田良才，盧崇恩.串葉松香草文集[M].太原：山西省生物研究所，1988.

［7］唐啟義，馮明光.實(shí)用統(tǒng)計(jì)分析及其DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[M].北京：科學(xué)出版社，2002.

［8］王秀紅，孫煊，苑波，等.一品紅試管快速繁殖技術(shù)研究[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（11）：38-40.

［9］賀美忠，王桂梅，楊富.桔梗組培快繁技術(shù)研究[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（12）：9-11.

［10］劉輝，邵德田.石刁柏全雄株的組培快繁技術(shù)[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（6）：113-114.

［11］孫瑞芬，李天然，李堃，等.草莓組培快繁及葉片誘導(dǎo)植株再生的研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2002，17（3）：49-53.

［12］李先芳，黃炎坤，王文靜，等.串葉松香草組織培養(yǎng)技術(shù)[J].河南科技，2001（9）：20.