華蟾素注射液對人肝癌HepG-2細胞增殖及周期的影響

孫 宇 盧辛辛 梁鑫淼 崔曉楠*

(1 大連醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，遼寧 大連 116002；2 中科院大連化學物理研究所，遼寧 大連 116023）

肝癌的藥物治療處于滯后狀態(tài)，目前化療藥物對肝癌的有效率均＜20%[1]，靶向藥物對于肝癌的治療還處于研究階段。尋找、研究有效的抗肝癌藥物一直是肝癌治療的熱點問題。華蟾素注射液（Cinobutacini injection，CINO） 為祖國醫(yī)學傳統抗腫瘤藥物蟾蜍的水溶制劑，其有效成分總稱為蟾蜍毒素類（Bufotoxins）, 包括蟾蜍甾二烯類、強心甾烯蟾毒類、吲哚堿類、醇類及多糖、氨基酸、肽類、腎上腺素等[2]，對多種腫瘤有抑制增殖的作用，尤其對肝癌的有效率可達44.4%[3]，是一個很有發(fā)展前景的抗肝癌藥物。但是，其作用機制還有待于進一步明確。本實驗探討華蟾素注射液對人肝癌HepG2細胞的增殖及周期有何影響，并初步分析可能存在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及培養(yǎng)

細胞株為人肝癌HepG2（購于中國科學院上海細胞研究所）；低糖IMEM培養(yǎng)基、10%新生牛血清購于GIBICO公司；將細胞置于培養(yǎng)箱中孵育（培養(yǎng)箱設為37℃、5%CO2、飽和濕度），每48h傳代1次。實驗細胞采用對數生長期細胞。

1.2 實驗藥品及試劑

華蟾素注射液（5mL/支，濃度以主要成分吲哚生物堿為標量測定，購于安徽省金蟾生化股份有限公司），實驗時應用培養(yǎng)基將其配制成不同濃度的藥液。MTT為biosharp公司產品；碘化丙啶和RNA酶A購于Sigma公司；CDK2/CyclinA激酶活性比色法定量檢測試劑盒購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。RT-PCR試劑盒購自Promega公司。

1.3 MTT法檢測細胞生長情況

將細胞接種到96孔培養(yǎng)板上，5000個細胞/孔，每組設立8個平行孔。培養(yǎng)24h后將培養(yǎng)基更為含不同濃度華蟾素注射液的培養(yǎng)液（0.006μg/mL、0.013μg/mL、0.026μg/mL、0.053μg/mL、0.105μg/mL、0.21μg/mL、0.42μg/mL），200μL/孔，設立空白對照組和陰性對照組（未加華蟾素注射液）。分別培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入20μL的MTT液（濃度為5mg/mL），再避光培養(yǎng)4h后除去培養(yǎng)液，加入二亞基亞砜（DMSO）150μL/孔，震蕩后使結晶完全溶解，置于酶標儀下將波長設為570nm，應用空白孔調零，測定各孔吸光值（B）。應用公式計算華蟾素注射液在不同濃度下對HepG2細胞生長的抑制率（IR）：IR（%）=（B對照-B試驗）/（B對照-B空白）×100%；半數抑制濃度（IC50）的計算：取細胞存活率和劑量對數作圖求出IC50值。實驗共重復4次。

1.4 流式細胞術檢測細胞周期分布

取細胞并將細胞配成2×106個/m2的濃度，分別取2mL接種到3個培養(yǎng)瓶內，培養(yǎng)24h后，應用PBS沖洗1次，進行同步化（即將培養(yǎng)基更為無血清的DMEM培養(yǎng)20h），再更為含有華蟾素注射液的正常培養(yǎng)基（其終濃度為0.21μg/mL），分別培養(yǎng)48h、24h、12h后，應用0.25%的胰蛋白酶消化下細胞，離心（1000r/min，10min）后棄去上清，應用冷PBS沖洗2次，再加入70%的冷乙醇，置于4℃下固定12h。用PBS沖洗2次，離心后棄去上清液，加入25μL濃度為2mg/mL的RNaseA，置于37℃下作用30min，再加入1mg/mL的PI染料25μL，于4℃下避光靜置30min后，應用流式細胞儀（發(fā)射波長630nm，激發(fā)波長488nm）檢測凋亡細胞的數量和細胞周期分布情況。實驗共重復4次。

表1 RT-PCR法檢測CDK2mRNA、CyclinA mRNA表達水平

1.5 RT-PCR法檢測CDK2mRNA、CyclinA mRNA表達水平

取細胞，接種于24孔板中，每孔 5×105個細胞，設華蟾素注射液濃度為0.42μg/mL、0.21μg/mL、0.105μg/mL為實驗組，設培養(yǎng)基組為陰性對照組，培養(yǎng)48h后收集各組細胞。提取各組總RNA時應用Trizol試劑盒（購于Invitrogen公司）并按其說明進行。RT-PCR的操作按照說明書進行（TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0），以cDNA為模板進行PCR擴增，反應條件見表1。

將擴增產物加入到濃度為1.5%瓊脂糖凝膠上，置于1×TBE緩沖液中，在電壓為90v作用下電泳30min，于紫外透視儀下觀察顯示電泳帶并用一次性成像儀掃描成像，然后進行灰度（ID）分析。實驗共重復4次。1.6 CDK2/CyclinA激酶活性比色法定量檢測

取細胞，將細胞配成1×105個/mL的濃度，取2mL接種于直徑為60mm的培養(yǎng)皿內，孵育24h后，分別加入華蟾素注射液（0.42μg/mL、0.21μg/mL、0.105μg/mL），并設立陰性對照組（未加藥物），培養(yǎng)48h，后續(xù)操作按該試劑盒內的說明書進行，并在酶標儀下（波長設為340nm）進行檢測。

樣品的活性=[（樣品讀數-背景讀數）×樣品稀釋倍數×0.1（體系容積，mL）]/[0.005（樣品容積，mL）×6.22（毫摩爾吸光系數）×0.6cm×5min]=U/mL

2 結 果

2.1 MTT法檢測腫瘤細胞生長狀態(tài)

不同濃度的華蟾素注射液干預HepG-2細胞24h、48h、72h 后，IC50分別為0.48μg/ mL、0.157μg/ mL、0.08μg/ mL，隨著作用時間的延長和藥物濃度的增加，其對細胞的抑制率逐漸增加，并與時間和濃度呈正相關。見圖1。

2.2 流式細胞術檢測細胞周期分布

濃度為0.105μg/mL的華蟾素注射液，作用HepG2細胞12h、24h、48h后，通過流式細胞儀檢測分析，結果示： S期HepG2細胞所占比例與藥物作用時間呈正比，具有時間依賴性，與對照組相比差異具有顯著性（P＜0.05）。見圖2。

2.3 RT-PCR法檢測CyclinA mRNA、CDK2mRNA表達水平

應用RT-PCR法檢測華蟾素注射液（0.105μg/mL、0.21μg/mL、0.42μg/mL）作用于HepG2細胞48h后，其CyclinA及CDK2 mRNA表達水平有何變化。實驗組與對照組比較，隨著藥物濃度的增加CyclinA mRNA、CDK2 mRNA表達水平減低，應用華蟾素注射液0.105μg/mL、0.21μg/mL、0.42μg/mL作用于HepG2細胞后，CyclinA mRNA與β-actin mRNA條帶灰度比值分別為（0.455±0.021）、（0.272±0.035）、（0.132±0.02），對照組灰度比值為（0.550±0.04），條帶3、4（即華蟾素注射液濃度為0.21μg/mL、0.42μg/mL）與對照組相比具有差異具有顯著性（P＜0.05），見圖3-1；CDK2 mRNA、β-actin mRNA條帶灰度比值分別為（0.266±0.021）、（0.167±0.015）、（0.117±0.020），對照組為（0.445±0.016），實驗組與對照組相比差異具有顯著性（P＜0.05），見圖3-2。

2.4 CDK2/CyclinA激酶活性比色法定量檢測結果

應用比色法定量法檢測華蟾素注射液作用于HepG2細胞48h后，CDK2/CyclinA激酶的活性與藥物濃度呈負相關，對照組與各濃度組間差異具有顯著性 （P＜0.05）。見圖4。

3 討 論

腫瘤為細胞周期疾病，通過阻斷細胞周期，實現對腫瘤的生長抑制是目前抗腫瘤藥物的重要機制。

我們的研究表明華蟾素注射液能抑制HepG-2細胞增殖，并將細胞阻滯于S期。為探討S期阻滯機制，我們觀察了華蟾素注射液對細胞周期素A（cyclinA）及細胞周期素依賴性激酶2（cyclins dependent kinases 2，CDK2）的影響。cyclinA是人類cyclins家族中重要成員之一，在細胞周期中起正相調節(jié)作用，它首次被檢測到是在原發(fā)性肝癌細胞中，在與HBV DNA的整合部位上，這種整合被認為是導致肝癌的主要原因。cyclinA存在于細胞核內，在DNA合成過程中的G1晚期出現，其作為調節(jié)亞基與相應的細胞周期素依賴性激酶（cyclins dependent kinases，CDK）中的CDK2、CDC2（cell division cycle 2）特異性結合，參與細胞DNA的復制及合成，并促進細胞進行分裂。CyclinA/ CDK2/CDC2復合物可使細胞順利完成并通過S期、G2/M期，如果該復合物表達出現異常，則可使具有缺陷的DNA喪失修復的時間而直接進入細胞周期，致使其出現異常增殖即生成腫瘤[4-7]；而且也是腫瘤細胞惡性增殖及預后不良的指標之一[8,9]。Dobashi Y等在對非小細胞肺癌的研究中發(fā)現CyclinA 、CDK2表達與S期細胞數量呈正相關與患者的生存期呈負相關[10]。本研究表明華蟾素注射液能下調CyclinA、CDK2mRNA水平表達，抑制CyclinA、CDK2活性。

我們的研究提示，華蟾素注射液可能通過影響CyclinA、CDK2實現對HepG-2細胞S期阻滯。

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