李艷花

（山西大同大學腦科學研究所，山西大同 037009）

擬南芥Formin家族蛋白AFH14基因的克隆及功能結(jié)構(gòu)域分析

李艷花

（山西大同大學腦科學研究所，山西大同 037009）

應用RT-PCR的方法從擬南芥cDNA中克隆了AFH14的全序列，并對其功能結(jié)構(gòu)域進行分析。發(fā)現(xiàn)所克隆的目的基因編碼區(qū)全長3 102bp，與基因組序列比對發(fā)現(xiàn)該基因包含18個內(nèi)含子和18個外顯子，編碼1 033個氨基酸殘基。通過與其它formin成員的序列比對分析，發(fā)現(xiàn)AFH14是一個典型的擬南芥II型formin，包括PTEN結(jié)構(gòu)域。

AFH14；Formin；PTEN；FH1；FH2

Formin蛋白是一類高度保守的多結(jié)構(gòu)域蛋白，在多個物種中都有較多的發(fā)現(xiàn)。而且，除了植物，幾乎現(xiàn)有的常用于細胞生物學研究的物種都有發(fā)現(xiàn)。formin是既和微絲互作也和微管互作［1-2］。植物formin根據(jù)結(jié)構(gòu)域組成上的不同分為I型和II型兩大類，目前關(guān)于植物formin的研究大都集中在I型formin上［3］，尚沒有關(guān)于高等植物II型formin的研究報道。AFH14屬于一個典型的II型formin，該基因的研究將拓展我們對植物formin蛋白家族成員的認識，有助于揭示它對微管微絲動態(tài)過程的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

供試材料為任海云實驗室保存的哥倫比亞0型野生擬南芥。種植條件：擬南芥種子在4℃冰箱中，冷處理3d，然后種植在Hoagland擬南芥培養(yǎng)基（含1.2％瓊脂，3％的蔗糖）上，光周期為光照16h，黑暗8h，溫度為22～24℃，生長至7d的小苗用來提取RNA。

1.1.2 試劑

RNA提取試劑盒購自奧萊博生物科技有限公司，DEPC水購自Sigma公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒：采用invitrogen的Superscript III，pfu DNA聚合酶，dNTP，DNA連接酶以及限制性內(nèi)切酶均購自Takara公司，DL2000plus Marker來自全式金。引物合成和測序由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司完成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥小苗RNA的提取和cDNA的獲得

1）擬南芥小苗總RNA的提取按照RNA提取說明書（AutoLab生物技術(shù)）說明書完成，并使用核酸蛋白測定儀檢測RNA均一性。

2）反轉(zhuǎn)錄cDNA獲得

體系中包括5 μg RNA，0.5 μg Oligod T，補DEPC-ddH2O至13.3μL。之后70℃，5min，冰浴至少2min。在上述體系中加入以下物質(zhì)：5 μL 5×M-MLV reaction buffer，5μL dNTP，0.7μL RNase Inhibitor，1μL M-MLV，補DEPC-ddH2O至25μL。42℃，60min溫育。

1.2.2 PCR擴增

應用Primer Premier 5軟件，根據(jù)已登錄TAIR數(shù)據(jù)庫中預測的AFH14的cDNA的序列和unigene中公布的EST序列設計引物：AFH14f：5＇ATGTCTTTGTTAAGTAGATTCTTTTACA3′，AFH14r：5＇TGTTCTATGTCTATGGATCTGCTG3′；使用TaKaRa的pfu系統(tǒng)，退火溫度為53℃，延伸3min，經(jīng)過35輪退火延伸。

1.2.3 基因克隆與序列分析

擴增產(chǎn)生核酸產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的條帶，回收產(chǎn)物與線性克隆載體pGEMT-5Z進行平端化連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a的感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選后挑取白色單克隆細胞進行擴大培養(yǎng)。選取經(jīng)瓊脂糖電泳、PCR、酶切檢測陽性的質(zhì)粒送英濰捷基公司測序，測序結(jié)果通過DNAman、Clustal W軟件進行序列拼接和比對分析。

2 結(jié)果

2.1 AFH14cDNA的克隆、鑒定及生物信息學分析

AFH14是一個典型的II型formin，NCBI上搜索，發(fā)現(xiàn)Genebank中含有AFH14的cDNA序列預測，而且基因組注釋中存在大量的關(guān)于該基因在植株中表達的microarray數(shù)據(jù)。因此本研究以AFH14為研究對象，擬采用RT-PCR方法擴增出該基因的CDS，從而為進一步研究該基因功能奠定基礎(chǔ)。

2.2 擬南芥AFH14cDNA的克隆、鑒定

2.2.1 總RNA及其質(zhì)量鑒定

總RNA的質(zhì)量好壞是反轉(zhuǎn)錄cDNA成敗的關(guān)鍵。本工作利用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)7d的擬南芥幼苗為材料，提取總RNA。取5μL擬南芥總RNA，加入1μL的6×Loading buffer，經(jīng)200V，5min瓊脂糖電泳，發(fā)現(xiàn)28S和18S條帶清晰，亮度比例大約2∶1，表明提取RNA質(zhì)量較好，見圖1。另外，取1μLRNA和99μL DEPC處理水，用核酸蛋白測定儀測定OD260和0D280的值，多次測定取平均值。計算OD260/0D280=2.0，表示所提取的總RNA純度比較高，沒有蛋白質(zhì)和基因組污染。

圖1 擬南芥總RNA瓊脂糖凝膠電泳

2.2.2 AFH14 CDS的擴增與鑒定

利用上述RNA為模板，經(jīng)Superscript III逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生cDNA，并以該cDNA為模板，以AFH14f和AFH14r為引物，按材料與方法中所述條件進行PCR。經(jīng)1.0％瓊脂糖電泳檢測，在3 000bp左右有明顯條帶，見圖2（箭頭所示），膠回收后并連接至pGEM-5Z Vector中得到質(zhì)粒pGEM-AFH14，克隆載體pGEM-AFH14經(jīng)PCR、酶切鑒定正確后，進行測序分析。測序分析表明所克隆到的序列長3 102bp，與TAIR上所預測的序列不完全一致，克隆片段缺少預測片段中從1 510～2 101的序列。進一步重復實驗證明，該基因的CDS中確實是沒有這一片段。通過與基因組序列比對分析發(fā)現(xiàn)AFH14基因包括18個外顯子，18個內(nèi)含子。

圖2 RT-PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果

2.3 AFH14全長蛋白結(jié)構(gòu)域及同源性分析

使用DNAMAN軟件分析顯示，擴增得到的AFH14核苷酸序列編碼的蛋白全長1 033aa，預測該蛋白的等電點為6.34，分子量為116.3kDa。像formin家族的其它成員，AFH14也是一個多結(jié)構(gòu)域蛋白，位于N-端是一個phosphatase tensin-related domain（PTEN）結(jié)構(gòu)域，包括1～394aa；一個富含脯氨酸的FH1結(jié)構(gòu)域位于489～594aa，脯氨酸含量高達48％。從595～1033aa是一個序列和功能都保守的FH2結(jié)構(gòu)域。通過與formin家族其它成員FH2結(jié)構(gòu)域序列比對，發(fā)現(xiàn)AFH14與AFH17、AFH18的FH2結(jié)構(gòu)域的同源性較高，分別高達52.14％和59.17％。而AFH17和AFH18的同源性高達83.02％。另外與formin家族其它成員擁有較多保守的氨基酸，在FH2結(jié)構(gòu)域存在保守的G-N-X-M-N motif，只是II型formin的M被L所替換。在這個motif周圍，也具備II型formin普遍存在的M-H-Y-L/Y-C-K motif。特別是與Bni1p的肌動蛋白結(jié)合和成核的K1 639、I 1431位點同源的氨基酸是保守的，K 1601僅被生化活性更強的R替換。這些保守序列暗示AFH14可能具有與Bni1p相似的微絲結(jié)合與成核能力3。

3 討論

晶體結(jié)構(gòu)和序列比對結(jié)果顯示，所有的formin在C-端均有一個核心基序：M-H-Y-L/Y-C-K。在這個核心基序的附近II型formin包含一個G-NX-M-N基序［3］，與formin蛋白的二聚化有關(guān)。通過與Bni1p的FH2結(jié)構(gòu)域比對，發(fā)現(xiàn)相對于Bni1p的K 1601、K 1639、I 1431是保守的微絲成核、正端封端與結(jié)合的位點［3］。AFH14這些基序和堿基都是保守的。只是K 1601的堿基被生物化學性質(zhì)相似的R所替換，這個可能并不影響formin蛋白的微絲成核活性。AFH14也包含有與FH2結(jié)構(gòu)域相鄰的富含脯氨酸的FH1結(jié)構(gòu)域，在TAIR的數(shù)據(jù)顯示，該結(jié)構(gòu)域比實驗中所獲得的序列要長，在預測和擴增得到的內(nèi)含子與外顯子交接處都存在5`GT和3`AG序列，推測可能是由于錯誤的評估了剪接位點的位置導致了CDS預測失誤。FH1結(jié)構(gòu)域中有48％的脯氨酸，與formin的FH1結(jié)構(gòu)域中脯氨酸含量平均值41％相似，所以認為該結(jié)構(gòu)域也是一個典型的FH1結(jié)構(gòu)域。在N-端有一個典型的II型formin特有的PTEN結(jié)構(gòu)域。首先與其它相類似的formin的PTEN序列進行比對，發(fā)現(xiàn)有40％～60％的相似性，另外和擬南芥的PTEN蛋白有20％相似性。對于該結(jié)構(gòu)域類型的formin實驗性研究很少，只有在moss的研究中發(fā)現(xiàn)與極性生長有關(guān)［4］。該類formin的報道大多是些生物信息學預測的知識。有文獻認為AFH14的PTEN結(jié)構(gòu)域與人的PTEN蛋白相似，但是保守的磷酸化位點T383被K替換，所以認為AFH14可能沒有了磷酸化的功能，可能只在該蛋白定位中起作用，而與功能不相關(guān)。同時也有文獻認為PTEN可能介導II型formin與膜性結(jié)構(gòu)相互作用的調(diào)控。在擬南芥有3個PTEN相關(guān)蛋白，其中AtPTEN1在花粉中表達，缺失該基因?qū)е禄ǚ鬯劳觯?］，AtPTEN2過表達導致雄性不育［6］。另也有文獻認為PTEN類似于tensin，可能通過黏連微絲與質(zhì)膜在信號通路中起作用。但是在我們的研究中發(fā)現(xiàn)PTEN可能與膜性結(jié)構(gòu)的關(guān)系并不密切，更可能是與細胞周期中微管、微絲相關(guān)的，作用方式有可能是直接的也有可能是間接的。通過序列分析我們可以清晰地發(fā)現(xiàn)，AFH14是一個序列非常保守的II型formin。

［1］Bartolini F，Moseley J，Schmoranzer J，et al.The formin mDia2 stabilizes microtubules independently of its actin nucleation activity ［J］.J Cell Biol，2008，181（3）：523-536.

［2］Deeksm，F(xiàn)endrychm，Smertenko A，et al.The plant formin AtFH4 interacts with both actin and microtubules，and contains a newly identified microtubule-binding domain［J］.J Cell Sci，2010，123（8）：1209-1215.

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〔編輯 楊德兵〕

Cloning and Sequence Analyzing of AFH14 Gene in Arabidopsis Thaliana

LI Yan-hua
（Institute of Brain Science，Shanxi Datong University，Datong Shanxi，037009）

The study of the function and properties of formins from plant cell is quite limited.In this study，Arabidopsis FH14（AFH14）has been cloned，analyzed.To obtain the full-length ORF，we performed RT-PCR to amplify a cDNA encoding the entire sequence of AFH14.The gene was found to encode 18 exons and 18 introns，and to encode a 3 102-nucleotide mRNA with a single open reading frame estimated to produce a 113.6-kD protein of 1 033-amino acid residues.The AFH14 protein consisted of three functionally distinct subdomains：an N-terminal PTEN（phosphatase tensin）-related domain，a prorich FH1 domain，and a highly conserved C-terminal FH2 domain.

AFH14；Formin；PTEN；FH1；FH2

X703.5

A

1674-0874（2011）03-0048-03

2011-01-08

李艷花（1977-），女，山西應縣人，博士，講師，研究方向：細胞生物學。