EDTA提高Microtox檢測有機化合物毒性靈敏度的研究

郝春慧 石長華 郭寅生 劉紅艷 黃正

(1.華中科技大學同濟醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院教育部環(huán)境與健康重點實驗室 湖北武漢 430030;2.湖北出入境檢驗檢疫局)

1 前言

Microtox利用污染物毒性大小與細菌發(fā)光強度變化存在相關關系進行急性毒性評價，應用于環(huán)境污染物毒性檢測已有30年歷史，在對重金屬、簡單有機污染物的毒性檢測中優(yōu)勢十分突出［1］，且已被我國(GB/T 15441－1995)和國際標準化組織(ISO11348－2007)列為急性毒性檢測標準方法。

Microtox所采用的明亮發(fā)光桿菌為革蘭氏陰性，現(xiàn)有研究已表明革蘭氏陰性細菌因其外膜上脂多糖分子的存在導致其對疏水性物質(zhì)進入細胞具有屏障作用［2，3］，由于 Microtox 標準方法中受試物與細胞作用的時間只有15min［4］，受試物短時間充分進入細胞受到脂多糖分子的屏障致使對結構復雜毒物檢測靈敏度呈現(xiàn)一定程度限制。但通過采用提高細胞通透性技術可望改善上述局限，目前國內(nèi)外還沒有這方面的報道。常見的用于增加細菌細胞通透性的物質(zhì)有:螯合劑(如EDTA)、多聚陽離子(如多粘菌素B和慶大霉素)、大分子的有機一價陽離子(如tris)及溶菌酶等。通過與細胞壁離子結合、去除肽聚糖結構等方式提高細胞膜通透性［5］，比如 I.M.Helander和 T.Mattila－Sandholm 2000年用熒光探針NPN檢測EDTA及Na－HMP對綠膿桿菌、大腸桿菌及沙門氏菌細胞外膜上脂多糖的釋放來研究細胞通透性的改變，發(fā)現(xiàn)EDTA能引起細胞外膜高達40%脂多糖的釋放［2］。

檢測通透性改變的方法有以產(chǎn)色的頭孢硝噻吩為底物檢測細胞內(nèi)β－內(nèi)酰胺酶的活性、用疏水熒光探針NPN檢測熒光強度、以放射性的14C標記脂多糖(LPS)及電鏡下形態(tài)觀察［2］等。本研究采用EDTA去掉細菌外膜脂多糖、提高細胞通透性，用疏水熒光探針NPN(在含水環(huán)境中熒光微弱，而進入細胞內(nèi)等非極性或疏水環(huán)境中熒光增強［2，3］)來檢測熒光強度的變化，證實細胞通透性的改變。最終通過提高明亮發(fā)光桿菌通透性來改善Microtox檢測有機化合物毒性靈敏度，并采用高通量分析手段提高檢測效率。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 菌種

明亮發(fā)光桿菌(Photobacterium phosphoreum T3變種)凍干粉，由中國科學院南京土壤所提供，－80℃超低溫冰箱保存。

2.1.2 主要儀器及試劑

Perkin Elmer－LS55型熒光分光光度計;TECAN－F200型多功能酶標儀;Fluotrac200 96孔板，;HQ－45B型恒溫搖床;WH－2型微型漩渦混合儀;722型分光光度計;IKA－KSBO型振蕩器;Eppendorf 5702 R型離心機。

N－苯基－1－萘胺(NPN，分析純):在棕色瓶中配溶解于丙酮(分析純)中的0.5mM NPN儲備液［3］，使用前用3%NaCl溶液稀釋;乙二胺四乙酸二鈉(EDTA－Na2，分析純)，200mM;支持緩沖液:NaCl 3%、Na2HPO40.5%、KH2PO40.1%、甘油0.3%，此緩沖液含 3%NaCl和 0.3%甘油，可以穩(wěn)定滲透壓和發(fā)光反應時間，后面統(tǒng)稱其為lumis緩沖液;供試化合物1，10－二氮雜菲、1，4－對位苯醌、雙酚A(BPA)、4－異丙基苯酚均為分析純，測試前除1，10－二氮雜菲用3%NaCl溶解，其余均用助溶劑二甲亞砜(DMSO，分析純，購自Sigma公司)配成一定濃度儲備液，然后分別取不同量溶解的有機物于3%NaCl溶液中配制成系列濃度測試液［6］。

2.2 方法

2.2.1 發(fā)光菌的培養(yǎng)

發(fā)光菌凍干粉用1mL3%NaCl復蘇，接入20mL液體培養(yǎng)基內(nèi)，25℃搖床培養(yǎng)12h(轉速約140r/min)，取10uL接入斜面培養(yǎng)基，經(jīng)25℃培養(yǎng)24h于暗室內(nèi)觀察可見明顯藍綠色發(fā)光后，放4℃冰箱備用。

2.2.2 菌懸液的準備

將4℃保存的上述斜面菌種轉接到20mL液體培養(yǎng)基，25℃振蕩增菌至暗室內(nèi)觀察有明亮發(fā)光，轉移到15mL離心管，3000rpm 10min離心，收集菌體并用lumis緩沖液制成菌懸液，調(diào)整菌液濃度至722－分光光度計于600nm處測得此菌懸液A=0.4左右為止［6］。

2.2.3 EDTA處理及通透性改變的檢測

檢測體系中菌懸液、EDTA及NPN的體積比為2:1:1，用3%NaCl稀釋EDTA梯度系列的終濃度至10、20、30、40、50mM，NPN 的終濃度為10uM，陰性對照組中EDTA及NPN的比例用lumis緩沖液補足。用Perkin Elmer－LS55型熒光分光光度計檢測熒光強度，且每個系列做三個平行樣。根據(jù)NPN的特性設定檢測的激發(fā)波長340nm，發(fā)射波長寬度300－500nm，狹縫寬度10nm。

NPN吸收系數(shù)=扣除陰性對照的菌液組熒光值/扣除陰性對照的緩沖液組熒光值。

2.2.4 EDTA對發(fā)光與菌數(shù)的影響

黑色96孔板為反應板，按1:1的比例先后加入菌懸液和40mM的EDTA，每組三個平行，振蕩反應15min后檢測發(fā)光。100uL菌懸液和100uL 80mM的EDTA混合涂布發(fā)光桿菌平板，以等量的菌懸液和lumis緩沖液為陰性對照，每組三個平行，25℃培養(yǎng)24h后菌落計數(shù)。

2.2.5 毒性檢測

用全黑平底96孔板，于1－6列的每孔中加60μL發(fā)光菌的菌懸液，多功能酶標儀檢測發(fā)光，并保證相同孔內(nèi)發(fā)光的標準偏差低于5%，然后于1－3和4－6列的每孔分別加80uL的lumis緩沖液和100mM EDTA，并迅速于B－H行按照濃度梯度由低到高的順序每行順次加入60μL的標準毒物，IKA－KSBO型振蕩器25℃恒溫準確振蕩15min，保證毒物與菌液充分結合，立即用多功能酶標儀檢測發(fā)光，A行為陰性對照。

2.2.6 發(fā)光細菌半數(shù)發(fā)光抑制濃度 EC50的計算［4］

抑制率=1－(樣品發(fā)光平均值/對照發(fā)光平均值)×100%

利用線性回歸分析建立化合物濃度(C)與抑制率(T)%之間的相關方程，計算對應發(fā)光抑制濃度EC50。

3 結果

3.1 通透性改變的檢測

各濃度的EDTA對熒光強度及發(fā)光細菌NPN吸收系數(shù)的影響見圖1及表1。從圖1及表1可見加入EDTA后，細菌對NPN的吸收系數(shù)明顯增加，其中濃度為40mM的EDTA對其影響最大，相對于不加EDTA的檢測系列，NPN吸收系數(shù)由8.8增加到13.0，最大增幅為47.7%，而過高濃度(50mM)的EDTA反而會抑制熒光物質(zhì)的吸收。

圖1 不同濃度EDTA對NPN熒光強度的影響

表1 EDTA濃度對發(fā)光細菌NPN吸收的影響

故后續(xù)實驗中均采用40mM EDTA處理明亮發(fā)光桿菌。

3.2 EDTA對發(fā)光與菌數(shù)的影響

40mM EDTA對菌體發(fā)光強度及菌落計數(shù)的影響示意圖見圖2，未加EDTA時每100uL A=0.4的菌懸液的發(fā)光強度及菌落計數(shù)的均數(shù)分別為8.3×105和6.34×106cfu/mL，加入 40mM EDTA 后分別為7.9×105和 6.35 ×106cfu/mL，經(jīng)配對設計的 t檢驗，均有P＜0.05，因而40mM EDTA對菌體發(fā)光強度及菌落計數(shù)的影響均沒有顯著性差異。

圖2 40mM EDTA對菌體發(fā)光強度及菌落計數(shù)的影響

3.3 化合物對發(fā)光菌的毒性

實驗所用4種供試化合物中，1，4－對位苯醌、雙酚A、4－異丙基苯酚均為水溶性極低的有機毒物。實驗中采用DMSO作為非水溶性毒物的助溶劑，并以DMSO對發(fā)光菌生物毒性效應的影響不超過1%所對應的濃度作為實際操作中允許加入的界限濃度［6］。實驗研究表明，在 DMS0濃度不超過10mM時，其對發(fā)光細菌發(fā)光強度的抑制率不超過1%［6］，滿足毒性測定要求。

化合物對發(fā)光菌的抑制作用見圖3。從圖3可見化合物對發(fā)光細菌的抑制反應的相關系數(shù)在加入EDTA前后均在0.99左右，其濃度與發(fā)光細菌的發(fā)光抑制效應呈顯著的負相關關系。4種化合物急性毒性由大到小的順序是1，4－對位苯醌、4－異丙基苯酚、雙酚A、1，10－二氮雜菲，加入40mM EDTA作用15min后，毒物的EC50值分別有不同程度的降低，依次為 36.48%、30.29%、23.96%、23.94%(表2)，且毒性順序沒有改變。

圖3 加入EDTA前后各化合物對發(fā)光菌的劑量－效應關系

表2 各化合物的EC50值(mg/L)

4 討論

早在1974年LORETTA LEIVE就曾做過利用EDTA來增加大腸類細菌細胞壁的通透性，使大分子藥物能更好的進入細胞提高藥效的研究［7］，隨后開始廣泛應用于臨床用藥研究［2，5］。本研究利用EDTA來改變明亮發(fā)光桿菌的通透性，效果顯著，用于Microtox，從而可以降低檢測限，提高檢測靈敏度。

本研究采用黑色96孔板［8，9］，每孔毒物和菌液的總量為200uL，整板的用量也不超過20mL，大大降低了檢測成本，可以同時檢測多個系列樣品，且便于多次平行測定從而提高準確度［10］，而且全部96孔的掃描時間也不足2min。

由于日益嚴重的環(huán)境污染和治理評價工作的需要，導致目前生物毒性分析的待測樣本量大，傳統(tǒng)毒性檢測方法成本高、工作量大、耗時長，無法快速判定多種有毒化合物的相互影響。將改變細菌細胞的通透性及利用微孔板的高通量檢測技術應用于污染物的微生物檢測，使微生物急性毒性試驗更為快速、靈敏、高效、準確，符合環(huán)境污染物毒性分析技術的發(fā)展趨勢，在大范圍污染物篩查、優(yōu)先污染物篩選、聯(lián)合作用分析等方面有廣泛應用前景。

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