高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法研究環(huán)維黃楊星D分散片的生物利用度＊

陳日來(lái)，李玉珍，謝守霞，李 東，王大果，李衡梅

(1.廣東省深圳市福田區(qū)第二人民醫(yī)院，廣東 深圳 518049; 2.廣東醫(yī)學(xué)院附屬福田醫(yī)院，廣東 深圳 518033;3.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，深圳市人民醫(yī)院，廣東 深圳 518020)

環(huán)維黃楊星D(cyclovirobuxine D，CVB－D)又稱(chēng)黃楊寧、環(huán)常綠黃楊堿D、黃楊堿等，是從黃楊木中提取的生物堿，屬孕甾烷衍生物，分子式為C26H46N20，具有行氣通絡(luò)止痛功能，主要用于治療氣滯血瘀所致胸痹心痛、脈結(jié)代、冠心病、心律失常[1]。CVB－D是繼麻黃素和青蒿素之后，從我國(guó)中藥寶庫(kù)中發(fā)掘出來(lái)的又一個(gè)具有劃時(shí)代意義的單體化合物，有良好的應(yīng)用前景[2]。但有關(guān)CVB－D在犬、兔、大鼠和人體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究[3－12]提示，其不同劑型的相同劑量在同一物種中的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)個(gè)體差異非常大;黃楊寧用于治療冠心病心絞痛具有即時(shí)療效，但血藥濃度極低。因此，在黃楊寧的新型制劑研究中，建立靈敏度高的測(cè)定方法并研究其藥代動(dòng)力學(xué)規(guī)律，對(duì)于制劑療效穩(wěn)定性與用藥安全評(píng)價(jià)等均具有重要的意義。筆者應(yīng)用高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC－MS2)法，建立了簡(jiǎn)便靈敏地測(cè)定生物樣品中CVB－D的方法，并研究了其分散片與普通片的相對(duì)生物利用度，為分散片的臨床應(yīng)用提供了參考依據(jù)。

1 材料與試藥

Thermo Finnigan LCQ液質(zhì)聯(lián)用儀(帶自動(dòng)進(jìn)樣器和Xcalibur軟件);Allegra 64R型離心機(jī)(美國(guó)貝克曼庫(kù)特有限公司)。CVB－D對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為888－200202，純度大于94%);內(nèi)標(biāo)左羥丙哌嗪對(duì)照品(深圳海王藥業(yè)有限公司，批號(hào)為05021011，純度大于99%);有機(jī)溶劑均為色譜純，去離子水由Purelab classic純水系統(tǒng)(ELGA Labwater，F(xiàn)rance)制備。受試制劑CVB－D分散片(自制，批號(hào)為091101，規(guī)格1 mg/片);參比制劑黃楊寧片(南京小營(yíng)制藥廠(chǎng)，批號(hào)為2010612，規(guī)格1 mg/片)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱:Hyperity C18柱(150 mm ×2.1 mm，5 μm)，柱溫:40 ℃;流動(dòng)相:10 mmol甲酸銨－甲醇－0.1%甲酸(20∶50∶30);流速:0.2 mL/min;自動(dòng)進(jìn)樣器溫度:4℃。電噴霧(ESI+)方式檢測(cè)(能量級(jí)為28%);噴霧電壓:5 kV;毛細(xì)管溫度:300℃;鞘氣流以及輔氣流分別為35和5，用于定量分析的離子對(duì)分別為 m/z 403.0→372.2(CVB － D)和 m/z 235.3→219.1(內(nèi)標(biāo))。

2.2 樣品處理方法

取血漿1 mL，加100 μL質(zhì)量濃度為43.6 pg/mL內(nèi)標(biāo)，再加入50 μL 50%的氨水，混勻 20 s，加入 5 mL三氯甲烷，震蕩 3 min，以2 600 r/min離心10 min，取下清液3.5 mL，置干凈玻璃管，于40℃水浴氮?dú)獯蹈?，最后殘?jiān)?00 μL流動(dòng)相溶解，進(jìn)樣20 μL。

2.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性考察:空白血漿、空白血漿加對(duì)照品和用藥后血漿樣品色譜圖見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，CVB－D、左羥丙哌嗪的保留時(shí)間分別為2.7 min和3.0 min左右，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定，專(zhuān)屬性強(qiáng)。ESI+條件下質(zhì)譜掃描見(jiàn)圖2。

圖2 質(zhì)譜掃描圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制:配制含CVB－D質(zhì)量濃度分別為 10，20，40，80，120，160，320 pg/mL 的血漿樣品，按 2.2項(xiàng)下方法處理。以 CVB－D峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(Y)為縱坐標(biāo)、血漿中CVB－D質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得回歸方程Y=0.000 308 625 C+0.001 84909，r=0.996 9(n=7)，權(quán)重系數(shù)為1/X。結(jié)果表明，CVB－D質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍是10～320 pg/mL，最小檢出質(zhì)量濃度為10 pg/mL。

精密度試驗(yàn):分別配制CVB－D低(20 pg/mL)、中(80 pg/mL)、高(160 pg/mL)3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度制備5份，分別在3 d內(nèi)連續(xù)測(cè)定其質(zhì)量濃度，計(jì)算日內(nèi)、日間誤差。結(jié)果見(jiàn)表1，可見(jiàn)方法有較高的精密度和準(zhǔn)確度。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

穩(wěn)定性試驗(yàn):根據(jù)樣品采集及分析過(guò)程，同時(shí)考察了低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品分別在－20℃(30 d)、室溫(8 h)、4℃(12 h)、反復(fù)凍融(3次)狀態(tài)下的穩(wěn)定性，每個(gè)濃度制備5份樣品，以測(cè)得的準(zhǔn)確度表示穩(wěn)定性。結(jié)果準(zhǔn)確度在92%～108%，表明樣品在各種條件下保存均有良好的穩(wěn)定性。

回收率試驗(yàn):結(jié)果見(jiàn)表2。可見(jiàn)，CVB－D和內(nèi)標(biāo)的平均萃取回收率大于85.33%，平均方法回收率在94.30% ～104.43%之間。

基質(zhì)效應(yīng)考察:取離心管數(shù)支，加入1 mL空白血漿，按2.2項(xiàng)下方法處理，空白血漿來(lái)自6個(gè)不同個(gè)體。另取離心管數(shù)支，用純水代替空白血漿后同法操作。計(jì)算血漿萃取物和純水萃取物的平均峰面積比值，考察基質(zhì)效應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，基質(zhì)對(duì)濃度信號(hào)的影響在 0.91 ～3.46%之間。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.5 人體生物利用度試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)計(jì):試驗(yàn)方案報(bào)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)。健康男性志愿者 18 人，平均年齡(23.2 ±1.5)歲，平均體重(62.6 ±7.6)kg，平均體重指數(shù)(BMI)為(21.4±1.7)。所有受試者試驗(yàn)前常規(guī)體格檢查和血液生化檢查示肝臟、腎臟功能基本正常。受試期間及試驗(yàn)前停服所有藥物，禁煙、酒。試驗(yàn)前受試者均簽署知情同意書(shū)。受試者于試驗(yàn)日的前晚開(kāi)始禁食12 h，第2天早晨7:30空腹開(kāi)始試驗(yàn)。采用自身對(duì)照、隨機(jī)交叉的方法，分別一次性口服受試藥CVB－D分散片2片(規(guī)格為1 mg/片)或?qū)φ账廃S楊寧片2片(規(guī)格為1 mg/片)，用200 mL溫開(kāi)水送服，服藥后禁食2 h，前后兩次給藥間隔時(shí)間為 2 周。服藥前和服藥后 0，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，10，12，24，48，72，120，144 h 共 16 個(gè)時(shí)間點(diǎn)從前臂靜脈取血，每次取血4 mL，分離血漿貯存于－20℃冰箱，待分析。所有的受試者試驗(yàn)期間未見(jiàn)其他不良反應(yīng)，試驗(yàn)結(jié)束后復(fù)查肝腎功能均基本正常。

結(jié)果:血藥濃度－時(shí)間曲線(xiàn)見(jiàn)圖3。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。單劑量給藥后，將受試藥與對(duì)照藥的 Cmax，AUC0－t，AUC0－∞進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示在制劑間均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，服藥周期亦無(wú)明顯影響(P ＞ 0.05)，但個(gè)體間存在明顯差異(P ＜ 0.01)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，AUC0－t的置信區(qū)間 為 84.5% ～112% ，AUC0－∞的置信區(qū)間為88.9% ～105%，Cmax的置信區(qū)間為93%～108% ，均符合等效標(biāo)準(zhǔn);Cmax，AUC0－t，AUC0－∞的雙向 t檢驗(yàn)結(jié)果同樣符合等效標(biāo)準(zhǔn);tmax經(jīng)非參檢驗(yàn)，結(jié)果合格。因此，受試藥與對(duì)照藥具有生物等效性。

圖3 血藥濃度－時(shí)間曲線(xiàn)

3 討論

與已有的方法[13]比較，本研究建立的測(cè)定方法檢測(cè)靈敏度高、樣本量少、分析時(shí)間短，CVB－D和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為2.0 min和2.7 min左右，大大縮短了分析時(shí)間，適合大批量樣本的分析處理。含CVB－D的血漿需經(jīng)堿化后再用有機(jī)溶劑提取，經(jīng)考察發(fā)現(xiàn)，堿量適當(dāng)加大，有利于提取完全，因此用50%的氨水進(jìn)行堿化，再分別用5 mL乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、三氯甲烷提取。結(jié)果表明，用三氯甲烷提取，基線(xiàn)噪音低，提取回收率較高，溶劑易揮干。根據(jù)CVB－D的結(jié)構(gòu)特征，篩選了許多內(nèi)標(biāo)物，結(jié)果以左羥丙哌嗪為內(nèi)標(biāo)物，峰形好，與被測(cè)物及血漿中內(nèi)源性物質(zhì)分離完全，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。

表3 主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(±s，n=18)

表3 主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(±s，n=18)

藥動(dòng)學(xué)參數(shù)AUC0－36(ng·h/mL)AUC0－∞ (ng·h/mL)Cmax(ng/mL)tmax(h)t1/2(h)F(%)受試制劑5 679.83 ± 1 548.21 7 464.21 ± 2 128.08 202.81 ± 43.30 5.76 ± 1.93 54.67 ± 12.43 99.4 ± 8.3參比制劑5 243.65 ± 1 317.39 7 021.43 ± 2 076.12 222.10 ± 50.90 5.22 ± 1.03 50.66 ± 13.63

人血漿中藥物濃度測(cè)定結(jié)果表明，兩種不同劑型的CVB－D在給藥后4 h血藥濃度達(dá)到最大，給藥后約48 h出現(xiàn)較明顯的血藥濃度回升的雙峰現(xiàn)象，考慮為腸肝循環(huán)的原因。本研究結(jié)果顯示，藥物的分布較迅速，消除速率較慢。由此可見(jiàn)，CVB－D在人體內(nèi)作用維持時(shí)間較長(zhǎng)，有利于心血管疾病的治療。

[1]譚 峰，顧 衛(wèi)，吳海科.環(huán)維黃楊星D的臨床與實(shí)驗(yàn)研究近況[J].中國(guó)中醫(yī)急癥，2005，14(7):683 －685.

[2]于民權(quán)，許 立，方泰惠，等.環(huán)維黃楊星D的藥理及毒理研究概況[J].安徽醫(yī)藥，2008，12(10):885 －889.

[3]余 鵬，狄 斌，劉文英，等.黃楊寧口腔速崩片人體藥代動(dòng)力學(xué)及相對(duì)生物利用度的研究[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2007，12(7):824－827.

[4]梁 濤.環(huán)維黃楊星D控釋片的研制、藥代動(dòng)力學(xué)及其PEG衍生物藥效學(xué)研究[D].南京:南京中醫(yī)藥大學(xué)，2008.

[5]余 鵬，劉文英，高 曙，等.環(huán)維黃楊星D在健康受試者體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2008，43(3):203－208.

[6]郝光濤，鄭專(zhuān)杰，姜 冰，等.黃楊寧分散片人體生物利用度和生物等效性研究[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2008，32(2):141－144.

[7]Peng Yu，Limin Zhou，Wenying Liu，et al.High performance liquid chromatography－tandem mass spectrometric determination of cyclovirobuxine D in human plasma[J].J Pharm Biomed Anal，2006，42(4):48 － 93.

[8]Ding L，Hu J，Jiang M，et al.Sensitive HPLC － APCI－MS method for the determination of cyclovirobuxine D in human plasma[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2006 ，843(1):78 －83.

[9]文紅梅，池玉梅，李 偉，等.HPLC－MS法測(cè)定犬血漿中環(huán)維黃楊星D濃度及其藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].中國(guó)天然藥物，2004，2(3):162－168.

[10]何 俊，王 焱，任曉亮，等.HPLC－MS法快速測(cè)定健康人體血漿中環(huán)維黃楊星D的濃度及其藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].天津中醫(yī)藥，2008，25(5):419－422.

[11]李秀梅，周莉玲，于 洋.環(huán)維黃楊星D透皮貼劑的藥動(dòng)學(xué)研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2009，20(3):231－234.

[12]梁 濤，劉 梅，陸 群，等.環(huán)維黃楊星D控釋片犬體內(nèi)生物等效性研究[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，23(5):329－333.

[13]王大果，曾灶昌，王啟平，等.柱前衍生化HPLC/UV法測(cè)定黃楊寧片中環(huán)維黃楊星D的含量[J].中南藥學(xué)，2009，7(7):484－486.