清熱化瘀方對腦缺血再灌注大鼠GDNF mRNA及其蛋白表達的影響1）

胡躍強，唐 農(nóng)，劉 泰，劉尊敬，祝美珍，胡玉英，范立雷

腦缺血損傷后，除了存在一種主動性的程序性細胞死亡（凋亡）過程，在耐受細胞內(nèi)還存在一種平行的主動性神經(jīng)元存活過程，而神經(jīng)營養(yǎng)因子就參與了這種主動性神經(jīng)元存活過程。膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）是轉(zhuǎn)化生長因子超家族成員，是一個最有效的營養(yǎng)因子[1]，對多種神經(jīng)元具有營養(yǎng)作用。它有促進多巴胺能神經(jīng)元的存活，促進神經(jīng)元軸突的定向生長以及促進運動神經(jīng)元損傷修復(fù)和神經(jīng)再生等作用。本實驗通過研究清熱化瘀方對腦缺血后GDNF mRNA及其蛋白表達的影響，以探討腦缺血后GDNF的表達變化規(guī)律及清熱化瘀方治療腦缺血的腦保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處理 SD大鼠96只，雌雄各半，體重250g±20g，隨機分為正常對照組（A組）、假手術(shù)組（B組）、模型組（C組）和清熱化瘀組（D組），后3組按處死時間分為術(shù)后3h、6h、12h、24h、3d、7d6個時間點，每個時間點5只動物。正常組大鼠不處理；假手術(shù)組線栓只插入頸內(nèi)動脈9mm，使大腦中動脈起始部不致阻塞；模型組造模后灌胃等體積的生理鹽水；清熱化瘀組動物造模后，以清熱化瘀湯（由水牛角、丹參、赤芍、地龍、石菖蒲等10味中藥組成）14g／（kg·d）灌胃。各組均在術(shù)前6 h灌胃一次，且6h、12h、24h、3d、7d時間點的動物在手術(shù)后清醒時開始灌胃，每天上、下午各一次，每次1.4mL／100g大鼠，其濃度及等效劑量按體表面積折算。

1.2 動物模型制作 參考Longa的線栓法制備局灶性大腦中動脈腦缺血模型。試驗過程和動物蘇醒期間，保持動物的體溫正常。

1.3 組織處理 將大鼠常規(guī)麻醉后，經(jīng)左心室先后用生理鹽水和4%的多聚甲醛進行灌注。然后取腦組織固定、脫水、石蠟包埋，按4μm厚度連續(xù)切片。

1.4 缺血半暗帶腦皮質(zhì)GDNF mRNA表達測定 原位雜交法，按試劑盒說明進行操作。

1.5 缺血半暗帶腦皮質(zhì)GDNF蛋白表達測定 免疫組化法。切片以1%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，滴加正常山羊血清封閉液室溫下孵育30min，接著分別滴加1∶100稀釋的小鼠抗大鼠GDNF單克隆抗體（Santa Cruz，USA），4℃過夜，然后以PBS洗滌。再滴加1∶100的二抗生物素化兔IgG（武漢博士德），PBS沖洗，切片以ABC試劑盒，按廠家說明進行處理。

1.6 結(jié)果觀察 在生物光學(xué)顯微鏡下觀察腦缺血周圍區(qū)的GDNF的陽性神經(jīng)元，采用HPIAS－1000彩色病理圖像分析系統(tǒng)進行分析，測定原位雜交和免疫組化陽性細胞染色的光密度（OD）值。每張切片測定4個視野（×400），取平均值作為測定值。

2 結(jié) 果

2.1 缺血半暗帶GDNF mRNA的表達變化 原位雜交顯示，正常對照組與假手術(shù)組可檢測到極弱的GDNF mRNA陽性染色細胞，腦缺血再灌注后3h其頂葉皮層表達水平開始增高（P＜0.05），6h達到高峰（P＜0.05），12h表達開始減弱（P＜0.05），3d后降至正常水平；清熱化瘀組其表達信號在缺血再灌注后3h、6h、12h、1d明顯強于模型組。詳見表1。

表1 各組大鼠GDNFmRNA表達的光密度值比較（±s）

表1 各組大鼠GDNFmRNA表達的光密度值比較（±s）

組別 3h 6h 12h 24h 3d 7d A組0.202±0.042 B組 0.210±0.049 0.206±0.060 0.195±0.054 0.198±0.046 0.211±0.048 0.213±0.058 C組 0.248±0.0641） 0.369±0.0661）2） 0.320±0.0601） 0.264±0.0531） 0.225±0.062 0.204±0.059 D組 0.272±0.0573） 0.398±0.0753） 0.357±0.0643） 0.302±0.0653） 0.233±0.061 0.218±0.063與B組和A組比較，1）P＜0.05；與其他時間點比較，2）P＜0.05；與C組比較，3）P＜0.05

2.2 缺血半暗帶GDNF蛋白的表達變化 正常對照組與假手術(shù)組可檢測到較弱的GDNF蛋白染色陽性細胞，腦缺血再灌注后3h其頂葉皮層表達水平開始增高（P＜0.05），6h達到高峰（P＜0.05），12h表達開始減弱（P＜0.05），3d后降至正常水平；清熱化瘀組其表達信號在缺血再灌注后3h、6h、12h、1d三個時間點明顯強于模型組。詳見表2。

表2 各組大鼠GDNF蛋白表達的光密度值比較（±s）

表2 各組大鼠GDNF蛋白表達的光密度值比較（±s）

組別 3h 6h 12h 24h 3d 7d A組0.162±0.038 B組 0.154±0.036 0.165±0.040 0.158±0.037 0.159±0.039 0.160±0.042 0.167±0.049 C組 0.183±0.0481） 0.236±0.0591）2） 0.201±0.0551） 0.190±0.0451） 0.176±0.054 0.162±0.036 D組 0.216±0.0603） 0.273±0.0703） 0.237±0.0653） 0.225±0.0563） 0.192±0.045 0.178±0.052與B組和A組比較，1）P＜0.05；與其他時間點比較，2）P＜0.05；與C組比較，3）P＜0.05

3 討 論

GDNF是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員，具有多種重要的生物學(xué)活性，不僅特異性地促進多巴胺能神經(jīng)元的存活，還對外周神經(jīng)系統(tǒng)及非神經(jīng)系統(tǒng)具有廣泛的作用。在胚胎發(fā)育過程中GDNF促進神經(jīng)元的存活、軸突的生長、控制神經(jīng)元的分化、調(diào)節(jié)突觸傳遞。此外，GDNF可減少神經(jīng)變性疾病中神經(jīng)元的變性壞死，同時也是該類疾病基因治療的候選神經(jīng)營養(yǎng)因子之一。

腦缺血損傷后，GDNF表達增加，以抑制遲發(fā)性神經(jīng)元損傷。在大鼠MCAO模型中，缺血30min再灌1h誘導(dǎo)GDNF表達，3h達高峰，24h后明顯減少，在再灌注72h后其表達出現(xiàn)第二次高峰[2]。Miyazaki等[3]報道短暫前腦缺血后，海馬GDNF的受體Ret表達升高，12h達高峰，給予GDNF腦室注射可顯著減少海馬CA1區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡。腦缺血后GDNF蛋白及受體的表達上調(diào)可能在腦缺血損傷后腦保護中起著重要的作用。GDNF對腦缺血后的神經(jīng)保護作用可能是通過以下幾條途徑來實現(xiàn)的：①抑制腦缺血損傷后半胱氨酸蛋白酶（Caspase）－1、3的表達，減少神經(jīng)元凋亡[4]；②減輕腦缺血后腦水腫[5]；③GDNF可減少NO的合成與釋放，通過抑制神經(jīng)元型NOS活性而發(fā)揮腦保護作用[6]。

腦梗死是臨床危重急癥之一，腦缺血后，引起多種炎癥反應(yīng)因子以及興奮性氨基酸大量釋放，激活NMDA受體，引起缺血級聯(lián)反應(yīng)，同時上述損傷也激活了神經(jīng)元的自我保護機制。由于GDNF是蛋白質(zhì)，不能通過血腦屏障，所以增加內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌的治療手段顯得尤為重要，中藥作為體內(nèi)微環(huán)境的調(diào)節(jié)劑，可能在此方面具有重要的作用。依據(jù)“毒邪致病”理論而設(shè)的清熱化瘀方由水牛角、丹參、川芎、地龍等中藥制成，其功能為清熱祛風(fēng)化痰、活血化瘀通絡(luò)、利水消腫，是治療腦梗死的有效方劑，一系列研究表明其通過不同途徑對腦缺血損傷組織具有保護作用，作為腦神經(jīng)功能保護劑在臨床運用有較好的療效[7－9]。

本研究從神經(jīng)營養(yǎng)因子的角度進一步研究清熱化瘀方對腦缺血損傷的保護作用。結(jié)果表明，缺血半暗帶GDNF mRNA及其蛋白均在腦缺血后3h出現(xiàn)明顯表達，6h表達達到高峰，以后逐漸降低。提示清熱化瘀方可能通過上調(diào)腦缺血后GDNF mRNA及蛋白的表達水平，從而保護受損神經(jīng)元。

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