復(fù)方丹參片對(duì)急性腦缺血大鼠藥理作用的探討1）

覃仁安，張超群，余小平，胡 華，周德生

復(fù)方丹參片主要由丹參、三七、冰片等組成。具有活血化瘀、理氣止痛等功效，臨床用于胸中憋悶、心絞痛，療效良好［1］。目前復(fù)方丹參片在治療腦缺血方面的實(shí)驗(yàn)報(bào)道為數(shù)不多，治療機(jī)制不詳。本研究采用Longa改良栓線法造成大鼠急性局灶性腦缺血模型，觀察復(fù)方丹參片對(duì)急性腦缺血大鼠治療效果，探討復(fù)方丹參片治療急性腦缺血大鼠的藥理作用。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥品 健康雄性Sprague－Dawley（SD）大鼠（湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，清潔級(jí)）約190只，體重（205±10）g。復(fù)方丹參片由廣州白云山和記黃埔中藥有限公司提供（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z44023372）。灌胃劑量相當(dāng)于生藥0.630g／kg，為成人劑量的7.0倍。血栓通膠囊（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025972），產(chǎn)自黑龍江省珍寶島制藥有限公司哈爾濱分公司，每粒裝0.18g（含三七總皂苷100mg）。

1.2 急性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷慕?參照Longa等腔內(nèi)線栓法［2］。動(dòng)物清醒后具備同側(cè)Horner氏征為研究對(duì)象。

1.3 分組與方法 將大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、血栓通膠囊組、復(fù)方丹參片組。正常組不造模，假手術(shù)組不插線，其余步驟與模型組相同。分別于24h，3d，7d等時(shí)間點(diǎn)灌胃。正常組蒸餾水10mL／kg灌胃。模型組造模成功后，蒸餾水10mL／kg灌胃。血栓通膠囊組、復(fù)方丹參片低劑量組和復(fù)方丹參片高劑量組均各自在急性腦缺血大鼠造模前1h灌胃，以后每隔12h灌胃1次。分別在各時(shí)間點(diǎn)結(jié)束后觀察神經(jīng)功能缺損評(píng)分，取腦組織，進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo) 在造模灌胃后24h、3d、7d觀察大鼠活動(dòng)情況、反應(yīng)狀況等一般癥狀。神經(jīng)功能缺損評(píng)分，按照Z(yǔ)ausinger六分法［3］。缺血腦組織和對(duì)側(cè)相應(yīng)部位腦組織的病理學(xué)檢查（HE染色）。梗死體積百分率：TTC染色。將染色后腦組織切片攝影輸入計(jì)算機(jī)，AutoCAD軟件計(jì)算每個(gè)大腦8個(gè)腦片16個(gè)平面腦梗死面積和損傷側(cè)總面積，以梗死面積占損傷側(cè)大腦總面積的百分比作為統(tǒng)計(jì)參數(shù)。血管新生相關(guān)蛋白指標(biāo)測(cè)定，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）的檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)（ABC法）；血管生成素（Ang）－1、Ang－2的檢測(cè)陽(yáng)性表達(dá)的部位采用Image－Pro Plus（IPP）圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行分析，400倍高倍鏡下每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野觀察，結(jié)果以積分光密度值（IOD）表示，取其平均光密度值。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 非治療組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分無(wú)顯著變化。治療組評(píng)分隨著時(shí)間的推移逐漸提高，且復(fù)方丹參片組評(píng)分高于其余組。詳見(jiàn)表1。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分及腦組織梗死面積比較（±s）

表1 各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分及腦組織梗死面積比較（±s）

組別 n 神經(jīng)功能缺損（分） 梗死面積（%）正常組24h 10 5.00±0.00 0.05±0.01 3d 10 5.00±0.00 0.03±0.05 7d 10 5.00±0.00 0.00±0.04假手術(shù)組24h 10 5.00±0.00 1.00±0.01 3d 10 5.00±0.00 0.01±0.02 7d 10 5.00±0.00 0.08±0.04模型組24h 10 1.00±0.45 46.01±0.09 3d 10 0.95±0.11 47.22±0.01 7d 10 0.60±0.21 46.02±0.02血塞通膠囊組24h 10 1.53±0.45 46.92±0.02 3d 10 1.65±0.56 46.02±0.612）7d 10 1.60±0.53 44.03±0.132）復(fù)方丹參片組24h 10 1.43±0.411） 48.01±0.08 3d 10 1.85±0.781） 46.00±0.022）7d 10 2.13±0.651） 41.00±0.122）與血塞通膠囊組比較，1）P＜0.05；與假手術(shù)組比較，2）P＜0.01

2.2 各組TTC染色法測(cè)腦梗死面積 腦組織TTC染色后，正常組織染成紅色，梗死灶染成白色。大腦中動(dòng)脈缺血再灌注后，梗死灶位于左側(cè)額葉、頂葉、顳葉皮層及新紋狀體外側(cè)部。正常組和假手術(shù)組大鼠的大腦切片經(jīng)TTC染色后未發(fā)現(xiàn)有腦梗死現(xiàn)象，模型組在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)后的梗死面積無(wú)顯著變化。模型組、血塞通膠囊組和復(fù)方丹參片組在24h后梗死面積無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在3d和7d后血塞通膠囊組和復(fù)方丹參片組梗死面積均有不同程度的縮小，其中復(fù)方丹參片組梗死面積減少更為顯著（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

2.3 缺血腦組織和對(duì)側(cè)相應(yīng)部位腦組織的病理學(xué)檢查 正常組、假手術(shù)組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)腦組織病理形態(tài)學(xué)無(wú)明顯改變，神經(jīng)元排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核核膜完整，核仁明顯。模型組、血塞通膠囊組、復(fù)方丹參片組1d，光鏡下可見(jiàn)腦神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、正常，未見(jiàn)腦水腫和其他病變，3d、7d后均有不同程度的腦皮質(zhì)和側(cè)腦室旁多發(fā)性軟化灶形成，部分腦組織小血管中可見(jiàn)血栓栓子，軟化灶周?chē)X組織水腫明顯。此病理性改變以模型組為重。造模后3d，模型組腦水腫仍很明顯，軟化灶內(nèi)還可見(jiàn)較多格子細(xì)胞；血塞通膠囊組軟化灶內(nèi)格子細(xì)胞更多，神經(jīng)元有不同程度的變性、壞死、脫失，并可見(jiàn)神經(jīng)元被吞噬現(xiàn)象，神經(jīng)元數(shù)量減少，并在其周邊區(qū)部位有小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)。這種現(xiàn)象在復(fù)方丹參片組也會(huì)發(fā)現(xiàn)，但是相對(duì)比較輕微。模型組、血塞通膠囊組、復(fù)方丹參片組7d，模型組部分大鼠腦內(nèi)有軟化囊腫形成，囊壁有膠質(zhì)細(xì)胞增生、肉芽組織形成，部分大鼠腦組織中可見(jiàn)較多的格子細(xì)胞，也有部分大鼠腦組織內(nèi)有肉芽瘢痕形成。復(fù)方丹參片組除少數(shù)大鼠腦內(nèi)有未完全機(jī)化的軟化灶以外，大部分可見(jiàn)肉芽瘢痕形成，在保護(hù)神經(jīng)元與增強(qiáng)病變修復(fù)方面作用均較明顯。

2.4 血管新生因子的表達(dá) 正常組、假手術(shù)組大鼠腦組織梗死灶周?chē)鷮?duì)應(yīng)部位僅有少量的VEGF、bFGF表達(dá)，主要為為黃褐色胞漿著色。模型組、血塞通組、復(fù)方丹參片組表達(dá)增加，VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其次為神經(jīng)細(xì)胞及血管，梗死灶周?chē)^核心顯著；bFGF在正常腦組織皮層低水平表達(dá)。bFGF蛋白在星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)水平較高，在神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)較弱。二者的陽(yáng)性表達(dá)在3d后達(dá)到高峰，7d后顯著下降。復(fù)方丹參片組的陽(yáng)性表達(dá)明顯優(yōu)于血塞通膠囊組（P＜0.05）。顯微鏡下觀察Ang免疫組化染色結(jié)果顯示，正常大鼠腦內(nèi)幾乎所有區(qū)域均為淡棕色，其中缺血邊緣組織染色較強(qiáng)。模型組大鼠腦缺血24h后大腦中動(dòng)脈供血區(qū)皮層表達(dá)明顯增強(qiáng)（OD值0.204 01）；3d后Ang在上述區(qū)域表達(dá)進(jìn)一步升高，達(dá)到最高值（OD值0.2491）；7d后大鼠上述區(qū)域Ang表達(dá)仍明顯高于正常組（OD值分別為0.214 00和0.210 02），但較再灌注24h組有所降低；在藥物治療組大鼠缺血區(qū)缺Ang表達(dá)更明顯。復(fù)方丹參片組Ang表達(dá)在3d組和7d組均明顯高于血塞通膠囊組（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2、表3。

表2 VEGF、BFGF在各組鼠大腦白質(zhì)的表達(dá)（±s）

表2 VEGF、BFGF在各組鼠大腦白質(zhì)的表達(dá)（±s）

組別 n VEGF BFGF正常組24h 10 1.00±0.11 1.00±0.41 3d 10 0.00±0.01 1.00±0.12 7d 10 0.10±0.02 2.00±0.03假手術(shù)組24h 10 1.15±0.40 1.05±0.12 3d 10 0.16±0.21 1.76±0.51 7d 10 0.26±0.42 1.01±0.55模型組24h 10 19.55±1.01 17.01±0.59 3d 10 20.11±0.42 19.23±0.57 7d 10 20.35±0.87 15.95±0.33血塞通膠囊組24h 10 29.36±1.01 19.41±0.45 3d 10 32.65±1.04 22.96±0.57 7d 10 30.53±3.13 17.99±0.48復(fù)方丹參片組24h 10 30.56±1.261） 18.01±0.131）3d 10 35.96±1.561） 25.36±0.441）7d 10 21.75±0.361） 21.56±2.45與模型組比較，1）P＜0.05

表3 Ang－1、Ang－2在各組鼠大腦白質(zhì)的表達(dá)（IOD sum）

3 討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為缺血性中風(fēng)是各種致病因素作用下發(fā)生的“腦絡(luò)瘀阻”，其病理因素有風(fēng)、火（熱）、痰（飲）、瘀、毒五種，病理關(guān)鍵是瘀血。治療性血管新生能有效地恢復(fù)腦組織血供，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、神經(jīng)保護(hù)和抗凋亡?；钛伸铕觯鲅t新血生，稱(chēng)之“祛瘀生新”。“生新”不僅是傳統(tǒng)意義上的生新血，而且還包含有“生新絡(luò)”的含義，瘀血去，則新血及新絡(luò)生，生新又反過(guò)來(lái)促進(jìn)瘀血的祛除。

血管新生是指在機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中或創(chuàng)傷修復(fù)、缺血缺氧和炎癥等情況下原有微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)生芽、遷移、增殖與基質(zhì)重塑等形成新毛細(xì)血管的過(guò)程［4］。VEGF具有特異性促內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂和血管生長(zhǎng)的作用，且依據(jù)其濃度不同發(fā)揮的作用也不同，低濃度時(shí)血管新生占優(yōu)勢(shì)，高濃度時(shí)血管發(fā)生占優(yōu)勢(shì)［5］。bFGF是一種多效能的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，bFGF能在細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換中誘導(dǎo)并促進(jìn)G0、G1期細(xì)胞進(jìn)入S期，從而實(shí)現(xiàn)成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的快速增殖與分化［6］。血管生成素是一組分泌型的細(xì)胞因子，該細(xì)胞因子家族在血管重塑、胚胎血管發(fā)育、癌癥等研究熱點(diǎn)中起著重要作用，具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)新血管生成［7］，在血管生成過(guò)程中其調(diào)節(jié)和引導(dǎo)作用，防治血管畸形的發(fā)生。腦缺血患者腦內(nèi)新生血管數(shù)目越多則生存時(shí)間越長(zhǎng)［8］。

本實(shí)驗(yàn)證明，復(fù)方丹參片可提高急性腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分，改善缺血組織的病理形態(tài)，縮小腦梗死面積，提高缺血腦組織的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF、bFGF）和血管生成素（Ang－1和Ang－2）水平，初步考慮復(fù)方丹參片以增加血管新生因子來(lái)促進(jìn)新生血管形成，但其具體作用機(jī)制及其環(huán)節(jié)，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

［1］曾昭枝.復(fù)方丹參片伍用阿司匹林治療中老年人心肌缺血的臨床觀察［J］.中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2010，6（6）：80.

［2］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats ［J］.Stroke，1989，20（1）：84－91.

［3］Zausinger S，Hungerhuber E，Baethmann A，etal.Neurological impaiment in rats after transient middle cerebral artery occlusion a comparative study under various treatment paradigms ［J］.Brai Res，2000，863（1－2）：94－105.

［4］Michael simons modern condepts in angiogenesis michael simons dartmouth medical school，USA Gabor m rubanyi cardium therapeutics inc，USA imperial［J］.College Press，2007，430.

［5］張愛(ài)梅，李憲章，王紀(jì)佐.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子治療缺血性腦血管?。跩］.國(guó)外醫(yī)學(xué)：腦血管疾病分冊(cè)，2008，11（10）：4.

［6］Nugent MA，Iozzo RV.Fibmblast growth flactor［J］.Int J Biochem＆ Cell Biology，2009，32（2）：115.

［7］Kim I，Kim HG，Moon SO，etal.Angiopoletln－1induces endothelial cell sprouting through the activation of focal adhesion kinase and plasmin secretion［J］.Circ Res，2000，86：952－956.

［8］Krupinski J，Kaluza J，Kumar P，etal.Role of angiogenesis in patients with cerebral isehemie stroke ［J］.Stroke，2006，25：1794－1798.