丙戊酸鈉對APP／PS1雙重轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠腦內(nèi)老年斑和神經(jīng)元的影響☆

龍志敏 趙蕾 高寶兵 汪克建 賀桂瓊

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一 種進(jìn)行性的不可逆的神經(jīng)退行性疾病，現(xiàn)已成為嚴(yán)重威脅老年人健康的四大疾病之一，是臨床最為常見的癡呆類型。神經(jīng)細(xì)胞外β淀粉樣蛋白(amyloid β peptide，Aβ)沉積形成的老年斑(senile plaques，SP)、細(xì)胞內(nèi)tau蛋白過度磷酸化聚集形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)、皮質(zhì)和海馬的神經(jīng)元丟失是AD腦的三大典型病理特征。然而，關(guān)于AD的病理過程，目前尚無一個學(xué)說能全面解釋，這導(dǎo)致AD的治療仍缺乏特異性。近期一系列研究發(fā)現(xiàn)，糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase 3，GSK-3) 同時參與 AD病理特征SP和NFT的形成及神經(jīng)元凋亡[1]。作為GSK-3β的選擇性抑制劑，丙戊酸鈉(valproic acid sodium salt，VPA)是否對AD患者腦組織起神經(jīng)保護(hù)作用，本課題擬用VPA處理APP／PS雙重轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠，結(jié)合免疫組化、甲硫素S染色、Nissl染色、TUNEL染色、ELISA定量檢測來探討VPA的神經(jīng)保護(hù)作用及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 APP／PS1雙重轉(zhuǎn)基因傳代小鼠的建立：將購于Jackson Lab雄性和雌性的APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因雜合體種鼠B6C3-Tg(APPswe，PSEN1de9)85 Dbo／J合籠，交配繁殖。待產(chǎn)下的后代達(dá)3周齡時用PCR進(jìn)行基因分型。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因分型 APP／PS1雙重轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定：剪子代小鼠鼠尾約0.5 cm，按照DNA提取試劑盒(Tiangen公司)步驟提取基因組DNA，核酸蛋白測定儀測定濃度后進(jìn)行PCR擴增，1.5%Agrose gel電泳檢測，紫外分析儀下觀察同時出現(xiàn)APP，PS1條帶的即為APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠(見圖1)。

PCR擴增：根據(jù)提供的引物擴增APP和PS1(以β-actin為內(nèi)對照)。APP引物上游 5′-CACCA CAGAATCCAAGTCGG-3′，下游 5′-CTTGACGTTCT GGCCTCTTCC-3′；PS1 引物上游 5′-CAGGTGCTAT AAGGTCAT-3′，下游 5′-ATCACAGCCAAGATGAGC-3′；β-actin 引物上游 5′-GACAGGATGCAGAAGGA GAT-3′，下游 5′-TTGCTGATCCACATCTGCTG-3′。反應(yīng)條件：94℃ ×5 min→(94℃ 30 s→ 58℃ 40 s→ 72℃ 40 s) 共 35個循環(huán)→72℃ 10 min(-20℃保存PCR產(chǎn)物)。APP基因PCR產(chǎn)物長350 bp，PS1 擴增片段長 608 bp，β-actin 為 446 bp[2]。

1.2.2 動物分組及藥物處理 待APP／PS1鑒定為陽性的小鼠取4月齡APP／PS1雙重轉(zhuǎn)基因小鼠24只，隨機分為A、B兩組(每組12只)。A組小鼠給予 VPA 腹腔注射，VPA 用藥量：30 mg／(kg·d)，用無菌生理鹽水稀釋(4℃保存)，腹腔注射，持續(xù)4周；B組注射等量生理鹽水作對照，每天上午固定時間給藥。所有實驗遵循重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物使用相關(guān)倫理要求。

1.2.3 動物標(biāo)本的制備 小鼠在藥物注射結(jié)束后，經(jīng)2%水合氯醛麻醉，斷頭，冰上取腦，左側(cè)腦組織放入4%多聚甲醛固定72 h，30%蔗糖脫水，待組織塊沉底后，恒冷切片機冠狀位連續(xù)切片，片厚 20 μm，切片入 1×PBST中，一部分切片采用漂浮法作免疫組化和Thioflavin S染色，一部分裱片留作Nissl染色和TUNEL染色。右側(cè)腦組織加蛋白裂解液勻漿，于4℃ 低溫以12000 r／min離心10 min，取上清保存于-80℃冰箱，用于 ELISA測定。

1.2.4 免疫組化染色 切片入88%甲酸，室溫下溶解老年斑中的不溶性Aβ 20 min，1×PBST漂洗5 min×3次，5%正常山羊血清室溫封閉60 min，轉(zhuǎn)移至一抗 4G8(濃度 1∶500)，4℃48～72h，1×PBST漂洗 5 min× 3 次，加入 ABC 混合液(1∶1000)，室溫30 min，1×PBST漂洗5 min×3次，DAB顯色后裱片，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片后光鏡下觀察。

1.2.5 Thioflavin S染色 切片浸入丙酮，室溫10 min，依次用70%和80%酒精、雙蒸水各沖洗30 s，0.1%KMNO4染色30 s，雙蒸水、70%和80%酒精各沖洗 30 s，0.1%Thioflavin S(溶于 80%乙醇)室溫染色15 min，80%和70%酒精、雙蒸水各沖洗30 s，裱片，水溶性封片劑封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 原位末端標(biāo)記(TUNEL)檢測 按照凋亡試劑盒(Roche公司)說明進(jìn)行操作：新制備的4%多聚甲醛室溫固定切片30 min，0.3%H2O2甲醇溶液室溫孵育30 min，0.1%TritonX-100在冰浴中孵育2 min，滴加TUNEL反應(yīng)混合物，37℃，60 min，滴加轉(zhuǎn)化劑-POD，37℃，30 min，每一步驟后均PBS洗片5 min×3次，DAB顯色后光鏡下觀察。結(jié)果判斷：棕黃色為陽性反應(yīng)顏色。每張切片選5個高倍視野計數(shù)陽性表達(dá)數(shù)。

1.2.7 ELISA 定量測定 Aβ40、Aβ42 的含量 按照ELISA試劑盒(R＆D公司)說明操作：將試劑盒及待測標(biāo)本置于室溫20～30 min，配制標(biāo)準(zhǔn)品濃度為：32、16、8、4、2 pg／mL，待作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 取出已包被的96孔板，在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，在待測樣品孔中加樣品稀釋液 40 μL和腦組織裂解樣品10 μL，半透膜封存，37℃溫育30 min。洗板，加酶標(biāo)試劑 50 μL，37℃溫育 30 min。洗板，加顯色劑 A、B 各 50 μL，37℃避光顯色 10 min，終止反應(yīng)，450 nm波長下讀取吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算Aβ40和Aβ42濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行獨立樣本t檢驗分析，實驗中形態(tài)學(xué)染色顯示的兩組小鼠腦內(nèi)SP的數(shù)量、凋亡神經(jīng)元數(shù)量及ELISA定量測得的Aβ水平均以x±s表示，檢驗水準(zhǔn) α ＝ 0.05。

2 結(jié)果

2.1 APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定 雌性和雄性的種鼠產(chǎn)下后代，剪鼠尾提取基因組DNA經(jīng)PCR擴增后，1.5%瓊脂糖電泳結(jié)果同時出現(xiàn)APP和PS1的條帶即為APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因陽性小鼠(圖 1)。

2.2 VPA處理后小鼠腦內(nèi)老年斑的變化

2.2.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示 VPA處理組和生理鹽水對照組小鼠大腦皮質(zhì)及海馬等區(qū)域均出現(xiàn)4G8陽性斑塊(即SP)，說明兩組小鼠腦組織都有Aβ沉積。對照組小鼠腦內(nèi)4G8陽性斑塊數(shù)量多，體積大；VPA處理組斑塊數(shù)量明顯減少，體積明顯縮小(圖2A)。取每只小鼠不同部位的5張腦片進(jìn)行陽性斑塊計數(shù)，結(jié)果顯示：A組小鼠大腦皮質(zhì)及海馬陽性斑塊數(shù)(單位：個)為(15.67 ± 2.52)，明顯少于 B 組對照組(42 ± 5.29)(t＝ 7.78，P ＜ 0.01)，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的基因分型

圖2 兩組小鼠大腦皮質(zhì)老年斑(SP)比較。a、b 4G8免疫組化染色 ×100，c、d Thioflavin S染色 100×

2.2.2 Thioflavin S染色結(jié)果顯示，生理鹽水對照組小鼠大腦皮質(zhì)及海馬等區(qū)域出現(xiàn)大量綠色熒光斑塊，而VPA處理組斑塊明顯減少，與免疫組織化學(xué)的結(jié)果一致(圖2B)。

2.3 VPA對神經(jīng)元的影響

2.3.1 Nissl染色結(jié)果 腦組織切片呈藍(lán)紫色，兩組均出現(xiàn)大量腫脹變圓球狀細(xì)胞，突觸消失，胞漿中可見尼氏小體明顯減少，出現(xiàn)較多凋亡或凋亡前期細(xì)胞，但VPA組中存在的正常神經(jīng)元多于對照組，且VPA處理組在皮質(zhì)區(qū)尤其是內(nèi)嗅區(qū)單位面積神經(jīng)元數(shù)目較生理鹽水對照組明顯增多，海馬CA各區(qū)厚度比對照組小鼠增厚，排列更整齊致密(圖 3)。

2.3.2 TUNEL染色結(jié)果 顯示兩組小鼠腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞均可見明顯染色陽性的凋亡細(xì)胞，細(xì)胞輪廓清楚，細(xì)胞核深染呈棕黃色，由于細(xì)胞凋亡時細(xì)胞核的DNA可滲透到胞漿，所以部分細(xì)胞胞漿也著色。VPA 治療組小鼠皮質(zhì)凋亡細(xì)胞(144.33±24.13)明顯少于對照組(81 ± 24.43)(t＝ 5.95，P ＜ 0.05)，有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(圖4)。

2.4 ELISA定量檢測腦內(nèi)Aβ水平

ELISA 結(jié)果顯示，VPA 治療組 Aβ40(777.50 ±161.58)pg／mL、Aβ42(232.50 ± 117.76)pg／mL 的生成較對照組 [Aβ40：(1092.5 ± 84.90)pg／mL，Aβ42：(925.00 ± 219.09)pg／mL]顯著減少(t分別為 4.23和 7.51，P ＜ 0.05)，且 Aβ42 減少更加明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 Nissl染色示皮質(zhì)海馬區(qū)神經(jīng)元的比較。皮質(zhì)出現(xiàn)較多凋亡或凋亡前體細(xì)胞，但VPA組(b)的正常神經(jīng)元多于對照組(a)，且 VPA 組的皮質(zhì)區(qū)(d)、海馬區(qū)(f)的神經(jīng)元密度大于對照組相應(yīng)腦區(qū)(c，e)。(a、b、c、d 400 ×，e、f 100 ×)

圖4 TUNEL染色示兩組小鼠皮質(zhì)凋亡細(xì)胞的比較(400×)，n＝9

3 討論

GSK-3是一種多功能的蛋白激酶。研究表明，GSK-3除參與糖代謝外，還參與細(xì)胞內(nèi)其他重要生理過程，如細(xì)胞的分化、增殖和凋亡及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等[3]。 GSK-3 主要有 2 種亞型：GSK-3a 和 GSK-3β。其中GSK-3β活性調(diào)節(jié)異常與人類多種疾病有關(guān)，如糖尿病、AD 等[4]。 近期一系列研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3β與AD病理特征SP和NFT的形成及神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)。因此學(xué)者提出了AD發(fā)病機制的新學(xué)說，即“GSK-3β 學(xué)說”[5]，認(rèn)為 GSK-3β 在 AD 發(fā)病機制中起核心作用。可見，GSK-3β是AD的一個潛在性治療靶點，開展以GSK-3β為靶點的藥物研究將為AD的有效防治開辟新途徑。

VPA是一種在臨床上得到廣泛應(yīng)用的廣譜抗癲癇藥物，近年對VPA的研究已突破了抗癲癇的范疇，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)VPA還具有神經(jīng)保護(hù)和抗凋亡作用。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)[6]，VPA是一種選擇性的GSK-3β抑制劑。因此，運用VPA治療AD便具有了可能性。

研究表明，人類APP和PS1基因突變與AD發(fā)病相關(guān)，轉(zhuǎn)入人類APP／PS1突變基因小鼠表現(xiàn)出與AD患者相似的病理與記憶缺陷，是一種理想而可靠的AD轉(zhuǎn)基因動物模型。與APP單轉(zhuǎn)基因小鼠相比，APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的優(yōu)點是發(fā)病更早、病變率更高、老年斑更明顯，因此該轉(zhuǎn)基因小鼠已被應(yīng)用于AD病因、發(fā)病機制及防治藥物的研究和開發(fā)[7]。

在AD的發(fā)病機制中，Aβ沉積是其中心環(huán)節(jié)。Aβ是由其前體蛋白APP分別經(jīng)β-、γ-分泌酶相繼作用產(chǎn)生。腦內(nèi)Aβ的主要形式是Aβ40和Aβ42，正常情況下二者的生成比例為 10∶1。 其中Aβ42極易纖維化聚集，形成具有神經(jīng)毒性的低聚體。 當(dāng)腦內(nèi) Aβ40／Aβ42 比例失調(diào)、Aβ42 產(chǎn)生過量，便導(dǎo)致具有神經(jīng)毒性的Aβ42在腦內(nèi)聚集、沉積，最終形成老年斑。老年斑主要分布在大腦皮質(zhì)及海馬等與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的腦區(qū)。大量研究表明，Aβ(尤其是 Aβ42)在大腦皮質(zhì)的堆積是AD病理發(fā)生的早期觸發(fā)因素[8-9]，因此阻斷或延遲AD早期Aβ的積聚成為治療AD的切入點。在前期工作中，我們分別用VPA處理7月齡、9月齡APP23+／-單轉(zhuǎn)基因小鼠，并進(jìn)行了行為學(xué)、形態(tài)學(xué)和蛋白水平測定，VPA可顯著改善AD模型鼠空間學(xué)習(xí)記憶的缺陷，可以減少腦內(nèi)老年斑的形成[10]，那么對于能更好的模擬AD疾病的APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因模型鼠，VPA是否能發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)功能呢？研究證明該模型鼠在4～5月齡時開始出現(xiàn)老年斑，因此我們選擇4月齡老鼠在老年斑產(chǎn)生初期進(jìn)行藥物處理，隨后進(jìn)行了免疫組織化學(xué)和Thioflavin S染色檢測，結(jié)果(圖2)顯示VPA組和對照組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬內(nèi)均出現(xiàn)了4G8陽性神經(jīng)元及陽性斑塊(老年斑)，但VPA組小鼠皮質(zhì)和海馬等區(qū)域的老年斑數(shù)量顯著少于對照組，且老年斑的體積也明顯小于對照組。為驗證老年斑數(shù)量減少是否源于Aβ水平降低，本實驗ELASA結(jié)果顯示，VPA處理組小鼠腦內(nèi)Aβ40和Aβ42水平均有顯著減少，其中以Aβ42減少更為明顯，說明VPA是通過降低Aβ的生成來減少了老年斑的聚集。

過多的Aβ具有細(xì)胞毒性，引起神經(jīng)細(xì)胞線粒體損傷，炎性反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡[11]。研究表明，Aβ的積聚能激活神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期并使細(xì)胞周期出現(xiàn)紊亂，從而也會引起細(xì)胞凋亡[9]。神經(jīng)病理學(xué)發(fā)現(xiàn)，AD最早期的病理變化為海馬內(nèi)突觸及可塑性受到損害、海馬以及內(nèi)嗅皮層出現(xiàn)神經(jīng)元丟失。VPA既然可以減少Aβ的形成，那它能否防止神經(jīng)元的丟失，在前期工作中，免疫熒光及銀染結(jié)果顯示，VPA注射組的APP23+／-小鼠海馬及大腦皮質(zhì)的神經(jīng)元胞體及突起數(shù)量明顯增多，且神經(jīng)纖維排列有序。在本實驗中，我們采用APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型，通過Nissl染色發(fā)現(xiàn)VPA注射組小鼠的海馬及大腦皮質(zhì)區(qū)尤其是內(nèi)嗅區(qū)的神經(jīng)元數(shù)量明顯增加(圖3)。在AD發(fā)生的過程中，內(nèi)嗅區(qū)的病變往往早于新皮質(zhì)的變化。鑒于基底前腦、海馬以及內(nèi)嗅區(qū)的纖維聯(lián)系，基底前腦-海馬-內(nèi)嗅區(qū)環(huán)路在AD發(fā)病中起重要作用。因此在內(nèi)嗅區(qū)的神經(jīng)元變化代表著AD的早期改變。為了進(jìn)一步驗證VPA所致的神經(jīng)元增多是否由腦內(nèi)神經(jīng)元的凋亡減少引起，我們進(jìn)行了TUNEI檢測。TUNEL可標(biāo)記組織細(xì)胞中核酸DNA片斷的3′-OH末端，為檢測DNA損傷的敏感方法，也是檢測AD腦中細(xì)胞凋亡的有力證據(jù)。在我們的研究中，VPA組小鼠海馬和皮質(zhì)區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)生理鹽水對照組明顯減少，且相對著色淺，說明VPA的確減少了小鼠腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡(圖4)。那么，其凋亡的相關(guān)機制又是什么，VPA所致的神經(jīng)元數(shù)量增加的又一原因——VPA是否促進(jìn)了小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元的再生，關(guān)于這些問題有待進(jìn)一步的研究。另外，tau蛋白過度磷酸化聚集形成的NFT是AD腦的另一病理特征，GSK-3β是引起tau蛋白磷酸化的主要激酶，那么，作為GSK-3β的抑制劑VPA，對于NFT又有什么影響，我們將繼續(xù)深入研究。

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