瑤藥地鉆(蔓性千斤拔)藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

王 碩， 袁經(jīng)權(quán)， 周小雷， 龔小妹， 陳乾平， 繆劍華*

(1．廣西藥用植物研究所姚新生院士重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530023;2．廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧5300021;3．暨南大學(xué)中藥及天然藥物研究所，廣東廣州510632)

蔓性千斤拔始載于《植物名實(shí)圖考》［1］，為瑤族地區(qū)常用藥，稱其為地鉆，為豆科千斤拔屬植物蔓性千斤拔 Flemingiae philippinensis(Merr．et Rolfe)Li的根［2］。廣泛分布于我國(guó)云南、四川、貴州、湖南、廣西、廣東、福建和臺(tái)灣等地［3］，具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)、強(qiáng)筋壯骨、消炎止痛、活血化淤、祛風(fēng)利濕等功效，被廣泛用于婦科、風(fēng)濕痹痛等類型的中成藥生產(chǎn)［4］，如婦科千金片、金雞沖劑、金雞膠囊、補(bǔ)血調(diào)經(jīng)片、壯腰健腎丸、活絡(luò)止痛丸、復(fù)方海蛇酊、復(fù)方挫傷靈、腦萎縮丸等［5-7］，研究表明蔓性千斤含有蔓性千斤拔素 C、蔓性千斤拔素 D、5，7，3'，4'-四羥基-6，8-雙異戊烯基異黃酮、flemichin D、nC22-C30烷酸、β-谷甾醇、羽扇豆醇［8］、α-衣蘭烯，異長(zhǎng)葉烯，8-石竹烯，卡達(dá)烯，金合歡醇異構(gòu)體［9］、iupinifolin、染料木苷(genistin)、槐屬苷、大黃酚、大黃素甲醚、大黃素、島青霉素、咖啡酸二十八烷酯、單棕櫚酸甘油酯、濱蒿內(nèi)酯、水楊酸、對(duì)甲氧基苯丙酸、白樺酸［10］、染料木素(genistein)、dorsmanins、osajin、eriosematin、lupinalbinA、3'-O-甲基香豌豆苷［11］?，F(xiàn)代藥理研究表明:千斤拔具有鎮(zhèn)痛和抗炎作用［12］、對(duì)周圍神經(jīng)損傷的保護(hù)作用［13］、對(duì)腦組織及血腦屏障的保護(hù)作用［14］、抑制血栓形成［15］等作用。蔓性千斤拔為廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)中收載品種［14］，但對(duì)其藥材未作定量測(cè)定要求，為了更好地開發(fā)利用這一植物資源，我們參考其內(nèi)容，結(jié)合藥典規(guī)定對(duì)10個(gè)不同產(chǎn)地樣品從藥材性狀、顯微特征、浸出物、總灰分、酸不溶性灰分和水分進(jìn)行了測(cè)定，采用了TLC及HPLC進(jìn)行了定性、定量研究，為制定蔓性千斤拔藥材的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)、開發(fā)新藥奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

儀器:210型高效色譜儀(美國(guó)VARIAN公司);KQ-5200型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);電子分析天平(CP2250D，Sartorius);LEICA生物顯微鏡(德國(guó)LaiLa);SX2-4JOA箱式電阻爐(上海比爾得儀器實(shí)業(yè)有限公司);101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海滬南科學(xué)儀器聯(lián)營(yíng)廠);W201型恒溫浴鍋(上海申生科技有限公司);高速萬能粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)。

試劑:甲醇、乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher公司);水為超純水;甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯為分析純(分析純，成都市科龍化工試劑廠)。

藥材:蔓性千斤拔藥材采自廣西不同的產(chǎn)地，經(jīng)馬小軍研究員鑒定為豆科千斤拔屬植物蔓性千斤拔Flemingiae Philippinensis(Merr．et Rolfe)Li。

對(duì)照品:染料木素(上海同田生物技術(shù)有限公司，批號(hào):10020611);染料木苷(上海同田生物技術(shù)有限公司，批號(hào):09062911)。

2 方法與結(jié)果

2．1 鑒別

2．1．1 粉末顯微特征 粉末灰黃色。色素紅棕色，方形或不規(guī)則形，大小不一。淀粉粒眾多，單粒類圓形、橢圓形、多角形，臍點(diǎn)點(diǎn)狀、人字形、十字形等。復(fù)粒有2-5分粒組成。木栓細(xì)胞棕黃色，類方形或多角形。草酸鈣方晶少見。多具緣紋孔導(dǎo)管，紋孔密。纖維成束或單個(gè)。

2．1．2 薄層鑒別 取千斤拔藥材粉末2 g，置于100 mL具磨口塞錐形瓶中，加入80%的乙醇50 mL，超聲提取30 min，過濾，濾渣用80%的乙醇沖洗干凈，與濾紙一并放入100 mL具磨口塞錐形瓶中，加入80%的乙醇50 mL，超聲提取30 min，過濾，合并濾液，減壓蒸干，用甲醇轉(zhuǎn)溶至10 mL量瓶中并定容，搖勻，作為供試品液。另取染料木苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄VB)試驗(yàn)，吸取不同產(chǎn)地供試品溶液各10μL、對(duì)照品溶液5μL，分別點(diǎn)在同硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-冰乙酸(9∶1∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈下(254 nm)檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。結(jié)果見圖1。另取染料木素苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄VB)試驗(yàn)，吸取不同產(chǎn)地供試品溶液各10μL、對(duì)照品溶液5μL，分別點(diǎn)在同硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-冰乙酸(6∶3∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈下(254 nm)檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。結(jié)果見圖2。

圖1 千斤拔藥材中染料木苷的TLC圖

圖2 千斤拔藥材中染料木素的TLC圖

2．1．3 理化鑒別 蔓性千斤拔藥材水提液于蒸發(fā)皿中，加入婓林試劑，在水浴上加熱數(shù)分鐘，觀察，結(jié)果顏色由墨綠色變?yōu)榇u紅色(檢查多糖成分)。

2．2 浸出物、總灰分、酸不溶性灰分和水分的測(cè)定

2．2．1 測(cè)定方法 浸出物測(cè)定參照藥典2010年版一部附錄XA浸出物測(cè)定法，采用冷浸法測(cè)定醇溶性浸出物，乙醇為95%;總灰分、酸不溶性灰分測(cè)定參照藥典2010年版一部附錄ⅨK灰分測(cè)定法;水分測(cè)定參照藥典2010年版一部附錄ⅨH水分測(cè)定法(烘干法)。

2．2．2 測(cè)定結(jié)果 10個(gè)不同產(chǎn)地的樣品的總灰分結(jié)果在3．17% ～6．08%之間，平均值為 4．55%，酸不溶性灰分結(jié)果在0．52% ～1．82%之間，平均值為0．98%。水浸出物結(jié)果在 8．59% ～16．11%，平均11．67%，醇浸出物結(jié)果 3．92% ～10．44%，平均6．74%，水分結(jié)果在 5．30% ～ 10．95%，平均9．11%，鑒于本品來自于野生資源，產(chǎn)地和采收情況比較復(fù)雜，灰分限量按照目前檢查樣品的平均值適當(dāng)上浮，暫定為總灰分不得過8%，酸不溶性灰分不得過2%，水浸出物不得少于7%，醇浸出物不得少于4%，水分不得大于10%。測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 各產(chǎn)地千斤拔水分、灰分及浸出物測(cè)定結(jié)果Tab．1 Results ofmoisture，ash and extract in Flem ingiae philippinensis

2．3 染料木素和染料木苷的測(cè)定

2．3．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 色譜柱:迪馬C18(4．6 mm ×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相:A 相為甲醇-乙腈(8∶1)，B相為0．06%磷酸水，梯度洗脫(20%～60%A，0～30 min):檢測(cè)波長(zhǎng)為 255 nm，柱溫為30℃，體積流量為1．0mL/min。在上述條件下樣品中染料木素和染料木苷與其他組分能夠達(dá)到基線分離，與相鄰的色譜峰分離度大于1．5，染料木素和染料木苷的理論塔板數(shù)不小于5 000，結(jié)果圖3。

圖3 蔓性千斤拔藥材供試品HPLC圖譜

2．3．2 供試品樣溶液的制備 同2．1．2項(xiàng)下供試品液的制備，最后以0．45μm的微孔濾膜過濾即得。

2．3．3 線性關(guān)系的考察 精密稱定染料木素對(duì)照品0．010 65 g、染料木苷苷 0．010 25 g，置 10 mL 量瓶中，用色譜甲醇溶解定容至刻度搖勻，得混標(biāo)對(duì)照品液A(其中染料木素質(zhì)量濃度為1．065 mg/mL、染料木苷質(zhì)量濃度為1．025 mg/mL)，從A中精密量取2 mL，置100 mL量瓶中，用色譜甲醇稀釋定容至刻度，得混標(biāo)對(duì)照品液B(其中染料木素質(zhì)量濃度為0．021 3 mg/mL、染料木苷質(zhì)量濃度為 0．020 5 mg/mL)，B搖勻后以0．45μm的濾液微孔濾膜過濾，自動(dòng)進(jìn)樣4、6、8、10、12、14 μL，以流動(dòng)相按 2．1．2 項(xiàng)條件層析，體積流量:1．0 mL/min，以峰面積(Y)對(duì)進(jìn)樣量(X)進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:染料木素:Y=131．19X+4．92(r=0．999 1)、染料木苷:Y=88．64X+3．48(r=0．999 3)。結(jié)果表明:染料木素對(duì)照品進(jìn)樣量在0．085 2 μg～0．298 2 μg之間、染料木苷對(duì)照品進(jìn)樣量在0．082 0μg～0．287 0μg之間時(shí)，進(jìn)樣量與峰面積之間有良好的線性關(guān)系。樣品溶液按標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的色譜條件進(jìn)樣，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2．3．4 精密度考察 取染料木素和染料木苷混標(biāo)B進(jìn)樣4μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，染料木素和染料木苷的RSD值分別為0．54%、0．66%。

2．3．5 穩(wěn)定性考察 取千斤拔藥材粉末2 g，按2．1．1項(xiàng)制備供試品，于 0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣 10 μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，染料木素和染料木苷的RSD值分別為1．875%、1．246%，結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．3．6 重復(fù)性考察 取千斤拔藥材粉末2 g，精密稱定，共6份，按2．1．1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣10μL，染料木素和染料木苷的RSD值分別為1．233%、1．729%。

2．3．7 回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定的千斤拔(含染料木素 0．106 7 mg/g、染料木苷 0．132 7 mg/g)藥材粉末6份，各1 g，精密稱定，精密加入1 mL染料木素對(duì)照品0．105 0 mg/mL、1 mL 染料木苷0．130 0 mg/mL，配制方法見2．1．1項(xiàng)，得供試品樣液，微孔濾膜濾過，進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果:染料木素的平均回收率為 97．30%(RSD=1．80%，n=6)、染料木苷的平均回收率為 94．85%(RSD=1．85%，n=6)。結(jié)果如表 2、3。

表2 千斤拔藥材染料木素的加樣回收率結(jié)果

表3 千斤拔藥材染料木苷的加樣回收率結(jié)果

表4 千斤拔藥材中染料木素和染料木苷的含有量

2．3．8 樣品測(cè)試 取供試樣品，過0．45μm的微孔濾膜過濾，精密吸取10μL進(jìn)樣，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算。結(jié)果表明:染料木素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0．024 5～0．139 9 mg/g;染料木苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0．058 9 ～0．228 9 mg/g，見表 4?？紤]本品來自于野生資源，產(chǎn)地和采收情況比較復(fù)雜，貯藏過程質(zhì)量的變化，擬定每克藥材染料木素不少于0．02 mg，染料木苷不少于0．05 mg/g。

3 討論

千斤拔藥材中有效成分檢測(cè)指標(biāo)的缺失嚴(yán)重影響其藥材質(zhì)量，建立千斤拔的定性定量的檢查方法對(duì)于保證千斤拔藥材的質(zhì)量具有重要意義。因此我們建立了千斤拔藥材中染料木素和染料木苷的薄層色譜檢識(shí)方法和高效液相色譜測(cè)定方法，并制定其限度，以期科學(xué)有效地控制藥材的質(zhì)量，保證其臨床療效。薄層色譜結(jié)果表明，10個(gè)不同產(chǎn)地千斤拔藥材樣品中，均檢出染料木苷，斑點(diǎn)清晰且方法簡(jiǎn)便、快速、可行，故此方法可用作千斤拔藥材的定性鑒別。

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