應用高速逆流色譜一次性分離白豆蔻中5-羥基-3，7，4'-三甲氧基黃酮

朱云霞， 劉 雯， 張繼全， 沈平孃*， 王玲玲， 卓 超

(1．華東理工大學藥學院，上海200237;2．國家中藥制藥工程技術研究中心，上海201203)

白豆蔻又名白蔻、豆蔻，為姜科植物白豆蔻Amomum kravanh Pierre ex Gagnep或爪哇白豆蔻Amonum compactum Soland．ex Maton的干燥成熟果實，按產(chǎn)地不同分為“原豆蔻”和“印尼豆蔻”。其性溫、味辛，歸肺、脾胃經(jīng)，有溫中止嘔、化濕行氣之功效。主治濕阻所滯、脾胃不和、脘腹脹滿、不思飲食、濕溫初起、胸悶不饑、胃寒嘔吐、食積不消，白豆蔻是臨床常用的芳香化濕藥［1］。

白豆蔻和爪哇白豆蔻多以果實入藥，含揮發(fā)油和黃酮類成分，普遍認為主含揮發(fā)油，白豆蔻揮發(fā)油中主要成分為 1，8-桉葉素，此外，含有 β-蒎烯，α-蒎烯，丁香烯，龍腦乙酸酯，α-松油醇、芳樟醇、葛縷酮、金合歡醇、及對聚傘花素等。白豆蔻中黃酮類成分主要是指甲基化的黃酮醇類化合物，包括5-羥基-3，7，4'-三甲氧基黃酮、5-羥基-3，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、3，7-二羥基-5，4'-二甲氧基黃酮、3-羥基-5，7，4'-三甲氧黃酮、5，4'-二羥基-3，7-二甲氧基黃酮、3，5，7，4'-四甲氧基黃酮、3，7-二羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮、5，3'-二羥基-3，7，4'-三甲氧基黃酮、3，5-二羥基-7，3'，4'-三甲氧基黃酮、3，5，3'-三羥基-7，4'-二甲氧基黃酮、3，5，7，3'，4'-五甲氧基黃酮等［2-3］。據(jù)藥理學表明，5-羥基-3，7，4'-三甲氧基黃酮具有防癌、抗癌、抗氧化、抗過敏、抗病毒、抗真菌等多種生物活性。可見，研究此類化合物的分離純化具有較重要的意義［4］，化學結(jié)構式如圖1所示。

圖 1 5-羥基-3，7，4'-三甲氧基黃酮Fig．1 Chem ical structures of 5-hydroxy-3，7，4'-trim ethoxyflavone

黃酮醇類化合物的分離純化方法很多，常見的有柱層析、薄層層析、鉛鹽沉淀、硼酸絡合、pH梯度萃取、溶劑萃取等，近年來，高速逆流色譜技術在天然黃酮醇類活性成分的分離與純化領域中應用越來越多［5］。

高速逆流色譜(High-Speed Countercurrent Chromatography，HSCCC)技術是近年來迅速發(fā)展的一種新型液-液分離技術，它避免了樣品的不可逆吸附、損失和污染。由于使用的是溶劑體系，其組成和配比可以無限多，從理論上講可以適合于任何極性范圍的樣品分離，具有很好的適應性;它對樣品的預處理要求較低，一般的粗提物即可分離，分離效率高、重現(xiàn)性好［6-7］。由于其分離的快速性及被分離物質(zhì)回收的便捷性使得分離、純化、制備可同步完成，近年來，HSCCC已經(jīng)廣泛應用于生物工程、天然產(chǎn)物、食品和化妝品等各領域的分離制備，如黃酮類化合物、生物堿、木脂素、蒽醌、大環(huán)內(nèi)脂類、抗生素和胡蘿卜素類等天然活性成分的分離制備，并將HSCCC與質(zhì)譜(HSCCC/MS)聯(lián)用，分析鑒定生物堿、木脂素及三萜類化合物等，均取得了滿意的結(jié)果［8-9］。本實驗首次采用HSCCC，選擇出合適的溶劑體系，從白豆蔻中分離出黃酮醇類成分，且用此方法一次性制備得到了高純度的5-羥基-3，7，4'-三甲氧基黃酮純品。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

TBE-300A型高速逆流色譜儀(上海同田生化有限公司)，?KTA purifier P-900泵，UV-900紫外檢測器(美國 GE Healthcare)，HX-1050恒溫循環(huán)器(北京博醫(yī)康)，Agilent 1100型高效液相色譜儀，包括DAD檢測器(美國Agilent公司)。

正己烷、乙酸乙酯、甲醇為分析純，水為超純水，HPLC所用甲醇為色譜純試劑，白豆蔻藥材由上?？禈蝻嬈邢薰咎峁?/p>

1．2 白豆蔻粗提物的制備

將白豆蔻粉碎為粗粉，取200 g粗粉加入1600 mL甲醇，回流提取3 h后，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸干，得棕黃色浸膏16．3 g，作為進樣物備用。

1．3 HSCCC的分離操作

兩相溶劑體系選用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶4∶8∶4)進行HSCCC分離操作，使用前用分液漏斗分開上下相，過濾，超聲處理20 min。將體積比為4∶1的上、下相溶液以10 mL/min的體積流量泵入管路，約20 min后停泵，啟動并調(diào)整主機轉(zhuǎn)速為900 r/min，然后以1．2 mL/min的體積流量將下相泵入柱內(nèi)，待上下相建立動態(tài)平衡，記錄上相被推出的體積，得上相保留著為67．5%［10］;白豆蔻粗提物用下相溶解，由進樣閥進樣;設定紫外檢測波長為274 nm，接收目標成分，減壓蒸干，TLC、HPLC分析分離結(jié)果。

1．4 HPLC 分析條件

色譜柱:CAPCELL PAK C18柱(4．6 mm ×250 mm，5μm);流動相:甲醇-水(78∶22);體積流量1．0 mL/min;柱溫:室溫;紫外檢測波長:274 nm;進樣量為10μL。

2 實驗結(jié)果

2．1 HSCCC條件的選擇與優(yōu)化

本實驗目標化合物為中等偏弱極性，因此選用了三個體系進行選擇與優(yōu)化，即正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、三氯甲烷-甲醇-水及環(huán)己烷-甲醇-水。分配系數(shù)K值［11］由HPLC分析測定:將適量的粗提物放入等體積混合的上下相混合均勻，用HPLC分別檢測上、下相中目標化合物的峰面積，分別記為AU和AL，則K=AU/AL。最終K值取三次測定的平均值，結(jié)果列于表1。

表1 樣品組分在各溶劑體系中分配系數(shù)測定結(jié)果Tab．1 K values of two components in some two-phase solvent systems

綜合K值和實際分離情況，發(fā)現(xiàn)正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶4∶8∶4)對目標化合物的分離度最高，且出峰時間合適，上相保留大，因而采用該體系作為HSCCC分離的體系條件。

實驗還研究了轉(zhuǎn)速、體積流量及溫度對分離效果的影響，最終選用轉(zhuǎn)速為900 r/min、體積流量為1．2 mL/min、溫度為室溫。HSCCC-UV圖譜如圖2所示，進樣30min后開始出峰，3 h內(nèi)出4個峰，分別對應收集流出液進行相關檢測。

采用薄層色譜對4號峰進行分析，展開劑為三氯甲烷-丙酮(16∶4)，用香草醛-濃硫酸溶液(5%香草醛乙醇溶液與濃硫酸以4∶1比例混合)顯色，為單一的橙紅色斑點［12］。

采用上述方法，對4號峰經(jīng)多次分離、富集后，將收集所得組分蒸干后最終得到3．41 g的淡黃色針狀結(jié)晶，所得收率為1．71%。

2．2 結(jié)構鑒定

2．2．1 核磁共振(NMR)對HSCCC分離峰的結(jié)構分析 1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ:12．68(1H，s，5-OH)，8．08(2H，d，J=11，H-2'，H-6')，7．03(2H，d，J=11．5，H-3'，H-5')，6．45(1H，d，J=2．5，H-8)，6．36(1H，d，J=2．5，H-6)，3．92(3H，s，OCH3)，3．89(3H，s，OCH3)，3．87(3H，s，OCH3)。13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ:178．8(C-4)，165．4(C-7)，162．0(C-4')，161．68(C-5)，156．76(C-9)，155．97(C-2)，138．87(C-3)，130．17(C-2'，C-6')，122．82(C-1')，114．06(C-3'， C-5')，106．06(C-10)，97．82(C-6)，92．16(C-8)，60．1(3-OCH3)，55．8(4'-OCH3)，55．4(7-OCH3)。對比參考文獻［13-15］，可確定為 5-羥基-3，7，4'-三甲氧基黃酮。

2．2．2 質(zhì)譜(ESI-MS)對HSCCC分離峰的結(jié)構分析 ESI-MS:m/z(%):328(［M］+，100)，329(15)，327(85)，309(12)，285(32)。以上數(shù)據(jù)與5-羥基-3，7，4'-三甲氧基黃酮的相對分子質(zhì)量吻合。

2．3 純度分析

將目標成分按照上述HPLC色譜條件進行分析，根據(jù)面積歸一化法，純度達到98%以上，結(jié)果見圖3所示。

2．4 回收率計算

采用外標法可以計算得到藥材中5-羥基-3，7，4'-三甲氧基黃酮的實際含有量，取三次計算的平均值為1．79%。將分離得到的相對標準品的量(1．71%)除以1．79%，即可得到5-羥基-3，7，4'-三甲氧基黃酮的回收率為95．5%。

3 討論

常規(guī)的分離技術，HSCCC技術預處理簡單方便，耗時短，分離純度高，回收率高。在以后的應用過程中，可采用HSCCC與常規(guī)分離方法相結(jié)合，進一步提高分離效率，使其更廣泛的應用于中藥分離領域。

圖3 白豆蔻粗提物(A)及HSCCC分離峰4(B)的HPLC圖譜Fig．3 HPLC chrom atogram s of crude extract from A．kravanh Pierre ex Gagnep(A)and HSCCC peak fractions4(B)

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