桑椹乙酸乙酯萃取物對(duì)鏈脲佐菌素致高血糖大鼠的降血糖作用

王瑞坡， 王 珂， 李 姣， 趙 迪， 王潔瓊， 瞿偉菁

(華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200062)

桑椹系桑科植物桑Morus albl L．的成熟果實(shí)。我國(guó)桑椹資源十分豐富，各省均有栽培。桑椹入藥的歷史悠久，是臨床常用中藥材，且歷代本草對(duì)其藥用價(jià)值有詳細(xì)記載，《中藥大辭典》有載:“《唐本草》中提到‘單食，主消渴’;而《本草綱目》則補(bǔ)充有‘搗汁飲，解酒中毒;釀酒服，利水氣，消腫’等”。目前，桑椹已被衛(wèi)生部列為“既是食品又是藥品”的藥食同源產(chǎn)品之一。近年來(lái)，桑椹的化學(xué)成分和藥理作用逐漸得到系統(tǒng)的研究［1］。桑椹提取物具有較好的抗腫瘤效果［2］、抗氧化能力［3］，同時(shí)桑椹還具有較好的降低血脂的作用［4-5］。而其各本草中所記載的“主消渴”即對(duì)血糖的調(diào)節(jié)功能方面的研究還很單薄，目前開(kāi)發(fā)出有關(guān)桑椹降血糖功能的產(chǎn)品如五子湯、糖寧等都是以桑椹為輔助藥材［6-7］，近期研究顯示桑椹多糖具有一定的降低血糖的效果［8］。桑椹中含有豐富的黃酮類(lèi)物質(zhì)，而以往的研究表明其他植物的黃酮提取物多具備較好的調(diào)節(jié)血糖的功效［9］，提示桑椹黃酮可能會(huì)有一定的調(diào)節(jié)血糖能力，因此展開(kāi)本項(xiàng)研究。由于熱醇提取法提取桑椹黃酮不可避免的會(huì)含有大量的花青素類(lèi)物質(zhì)，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展，因此本實(shí)驗(yàn)采用乙酸乙酯萃取獲得粗黃酮并進(jìn)一步展開(kāi)研究，以期對(duì)傳統(tǒng)中藥桑椹的降糖功效找出現(xiàn)代科學(xué)解釋和依據(jù)。

1 材料

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量200～220 g，3月齡，購(gòu)自西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格號(hào):scxk(滬)2007-0016。

1．2 藥品 鏈脲菌素(Streptozocin，稱(chēng) STZ，Sigma公司產(chǎn)品，用pH 4．6的檸酸鹽緩沖液配制(4℃預(yù)冷，現(xiàn)用現(xiàn)配);格列苯脲(Glibenclamide，北京太平洋藥業(yè)有限公司，批號(hào):050503);其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1．3 試劑盒 血清葡萄糖(BG)、血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、堿性磷酸酶(ALP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒，購(gòu)自上?？菩郎锛夹g(shù)研究所;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、糖化血清蛋白(GSP)、購(gòu)自南京建成生物工程研究所;胰島素放免試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)。

1．4 儀器 梅特勒-托利多B-L系列電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，TL-16R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海市離心機(jī)械研究所)，T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用有限公司)，DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，雅培安妥超越血糖儀和血糖試紙條(美國(guó)雅培公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 桑椹乙酸乙酯萃取物的制備 選取一定量的干燥桑椹粉碎過(guò)60目篩，石油醚充分除脂，風(fēng)干，然后70%乙醇80℃回流提取3 h，共提取3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇至浸膏狀，熱蒸餾水溶解，乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯得到最終的萃取物(稱(chēng)EEM)。

2．2 STZ致高血糖Wistar大鼠模型的構(gòu)建、分組正常雄性Wistar大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，禁食12 h，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)選用50 mg/kg體質(zhì)量劑量腹腔注射無(wú)菌檸檬酸緩沖液(0．22μm微孔過(guò)濾，pH 4．6)配置的4%STZ溶液。120 h后，尾靜脈采血測(cè)定禁食6 h的空腹血糖(FBG)，F(xiàn)BG＞10 mmol/L的大鼠為成型大鼠。而后隨機(jī)分為模型對(duì)照組、陽(yáng)性藥物組和EEM低、中、高3個(gè)治療組，每組10只，組間血糖差異小于0．1 mmol/L;同時(shí)另設(shè)一正常對(duì)照組。

2．3 給藥及降血糖實(shí)驗(yàn) 陽(yáng)性藥物格列本脲灌胃劑量為20 mg/kg體質(zhì)量，EEM低、中、高劑量組分別按照0．1 g/kg 體質(zhì)量、0．2 g/kg 體質(zhì)量、0．3 g/kg體質(zhì)量劑量灌胃EEM，每日9∶00一次性灌胃，同時(shí)模型對(duì)照組和正常對(duì)照組均灌胃等體積的蒸餾水，連續(xù)灌胃21 d。分別于第0、7、14、21天尾靜脈采血，測(cè)定血糖;灌胃開(kāi)始第22天，處死大鼠，取其血液和內(nèi)臟進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

2．4 口服糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT) 治療12 d時(shí)，禁食16 h，各組大鼠分別灌胃相應(yīng)的蒸餾水、20 mg/kg體質(zhì)量的格列本脲、0．1 g/kg體質(zhì)量、0．2 g/kg體質(zhì)量、0．3 g/kg體質(zhì)量的EEM，30 min后，各組大鼠按2 g/kg體質(zhì)量劑量灌胃葡萄糖溶液，測(cè)定口服葡萄糖后 0、15、30、60、120 min 的血糖值(血糖儀及試紙條測(cè)定)，并繪制糖耐量曲線(xiàn)。

3 結(jié)果與分析

3．1 對(duì)高血糖大鼠空腹血糖的影響 如表1所示:灌藥第2、3周EEM中劑量組血糖值均顯著低于模型對(duì)照組，降糖幅度分別 22．43%、35．58%，同時(shí)EEM低、高劑量組在第3周也出現(xiàn)了顯著的效果，降糖幅度分別為25．30%和24．57%;陽(yáng)性藥對(duì)照組在第3周表現(xiàn)出極顯著的降糖效果，降糖幅度為34．74%。結(jié)果表明各劑量組均可顯著降低糖尿病大鼠的血糖水平。

3．2 對(duì)高血糖大鼠葡萄糖負(fù)荷后血糖濃度及血糖曲線(xiàn)下面積的影響 高血糖大鼠葡萄糖負(fù)荷后全血血糖如圖1所示:與正常組相比，模型組負(fù)荷后0．5、1、2 h血糖值均極顯著升高，說(shuō)明高血糖大鼠糖耐量極顯著降低，受損嚴(yán)重;EEM中劑量組在糖負(fù)荷后0．5和1 h均能顯著降低血糖水平;EEM低、中劑量組在糖負(fù)荷后0．5和1 h一定程度作用，但均未達(dá)到顯著水平。提示EEM高劑量能改善高血糖大鼠的糖耐量異常，有急性的降糖作用。

表1 EEM對(duì)高血糖大鼠血糖水平的影響Tab．1 Effect of EEM on serum glucose in diabetic rats(n=10)

圖1 EEM對(duì)高血糖大鼠糖耐量實(shí)驗(yàn)影響Fig．1 Effect of EEM on glucose tolerance test in diabetic rats

高血糖大鼠葡萄糖負(fù)荷后全血血糖曲線(xiàn)下面積如圖2所示:模型組與正常組相比，血糖曲線(xiàn)下面積極顯著升高，說(shuō)明模型組大鼠糖耐量受損嚴(yán)重;與模型組相比 EEM高劑量組血糖曲線(xiàn)下面積顯著降低，提示高劑量的EEM能夠改善糖負(fù)荷后高血糖大鼠糖耐量異常，格列本脲組、EEM低、中劑量組無(wú)顯著差異。

3．3 對(duì)高血糖大鼠糖化血清蛋白的影響 在高糖環(huán)境中血清蛋白可與血清中葡萄糖發(fā)生非酶促反應(yīng)形成具有酮胺鍵糖化血清蛋白，又稱(chēng)果糖胺(FTS)。FTS在血清中的濃度比較穩(wěn)定，不受血糖暫時(shí)波動(dòng)影響，可很好反應(yīng)2～3周的血糖水平［10］，大鼠糖化血清蛋白質(zhì)量濃度如表2所示:與正常組相比，模型組糖化血清蛋白質(zhì)量濃度極顯著升高;EEM中劑量組與模型組相比，糖化血清蛋白水平顯著降低;EEM高劑量組與模型組相比，未達(dá)到顯著差異，陽(yáng)性藥物組和EEM低劑量組FTS水平有所下降，但未達(dá)到顯著水平。

圖2 EEM對(duì)高血糖大鼠糖負(fù)荷后血糖曲線(xiàn)下面積的影響Fig．2 Effect of EEM on AUC after glucose loading in diabetic rats

表2 EEM對(duì)高血糖大鼠果糖胺水平影響Tab．2 Effect of EEM on glycosylated serum proteinin diabetic rats(n=10)

3．4 EEM高血糖大鼠血清胰島素濃度的影響 空腹血清胰島素(Insulin，INS)濃度如表3所示:模型組的INS遠(yuǎn)低于正常組，說(shuō)明經(jīng)STZ注射的大鼠胰島功能受損，造模成功;與模型組相比，各劑量EEM均能顯著提升INS含量;格列本脲組INS也較模型有所提高，但未達(dá)到顯著水平。提示EEM可以促進(jìn)胰島素的分泌。

表3 EEM對(duì)STZ誘導(dǎo)的高血糖大鼠血清胰島素水平的影響Tab．3 Effect of EEM on serum insulin content in STZ-diabetic rats(n=10)

3．5 EEM對(duì)高血糖大鼠體質(zhì)量和血脂水平的影響

3．5．1 EEM對(duì)高血糖大鼠體質(zhì)量的影響 EEM對(duì)STZ致高血糖大鼠體質(zhì)量水平的影響如表4所示:與正常組相比，模型組大鼠體質(zhì)量極顯著降低;與模型組相比，EEM中劑量組體質(zhì)量極顯著升高，EEM高劑量組體質(zhì)量顯著升高，低劑量組和格列本脲組則無(wú)顯著變化。提示EEM中、高劑量組可以緩解糖尿病大鼠的生長(zhǎng)異常。

表4 EEM對(duì)高血糖大鼠體質(zhì)量水平的影響Tab．4 Effect of EEM on body weight in diabetic rats(n=10)

3．5．2 EEM對(duì)高血糖大鼠血脂水平的影響 EEM對(duì)高血糖大鼠血脂水平的影響如表5所示:模型組與正常組相比，TC水平極顯著升高同時(shí)TG量顯著降低，提示模型組大鼠脂代謝可能出現(xiàn)紊亂;格列本脲治療組與模型組相比可顯著提高TG量，HDL-C量影響不明顯;與模型組相比EEM各個(gè)劑量組TG、HDL-C水平均顯著升高。提示EEM對(duì)血脂具有較好的調(diào)節(jié)作用。

3．6 EEM對(duì)高血糖大鼠血清SOD活性及MDA的影響 表6所示:各組血清總SOD活性均無(wú)顯著差異。與正常組相比，模型組血清的MDA水平略有升高，提示模型組大鼠抗氧化能力下降;與模型組相比，EEM各個(gè)劑量組血清MDA水平均顯著降低，格列本脲治療組血清MDA水平也顯著降低。提示EEM可以改善大鼠的抗氧化能力。

表5 EEM對(duì)高血糖大鼠血脂水平的影響Tab．5 Effect of EEM on serum lipids in diabetic rats(n=10)

表6 EEM對(duì)高血糖大鼠MDA水平和血清SOD活性的影響Tab．6 Effects of EEM on MDA level and SOD activity in diabetic rats(n=10)

3．7 EEM對(duì)高血糖大鼠臟器的影響

3．7．1 EEM對(duì)高血糖大鼠肝功能指標(biāo)的影響EEM對(duì)高血糖大鼠ALP、ALT及AST活性的影響如表7所示:與正常組相比，模型組大鼠血清ALP、ALT活性極顯著升高同時(shí)AST活性亦有一定程度上升，提示高血糖大鼠肝臟受損;格列本脲治療組對(duì)血清ALP及ALT活性均無(wú)顯著影響;EEM各個(gè)劑量組對(duì)血清ALP及ALT活性影響均較小;同時(shí)各個(gè)治療組均顯著提升了血清AST活性。提示格列本脲和EEM可能會(huì)對(duì)肝臟有一定的副作用。

3．7．2 EEM對(duì)高血糖大鼠腎臟功能指標(biāo)的影響如表8所示:模型組血清尿素氮水平遠(yuǎn)高于正常對(duì)照組，說(shuō)明高血糖大鼠的腎臟功能受到了一定程度的損傷;格列本脲治療組和EEM的低劑量組與模型組相比雖說(shuō)有一定程度的緩解，但是未達(dá)到顯著水平;EEM中劑量組能夠顯著緩解腎臟功能的損傷;EEM高劑量組血清BUN含量有一定程度的升高，但未達(dá)到顯著水平。提示EEM 0．2 g/kg對(duì)高血糖大鼠具有較好的腎臟保護(hù)的功能。

表7 EEM對(duì)高血糖大鼠血清ALP、ALT和AST活性水平影響Tab．7 Effects of EEM on activities of serum ALP，ALT and AST in diabetic rats(n=10)

表8 EEM對(duì)高血糖大鼠血清尿素氮水平影響Tab．8 Effect of EEM on BUN in diabetic rats(n=10)

4 討論

糖尿病引起的脂質(zhì)代謝異常是動(dòng)脈粥樣硬化的重要誘因［11］，EEM在穩(wěn)定血糖的同時(shí)對(duì)血脂也有極顯著的積極效果。結(jié)果表明EEM可以穩(wěn)定血清TG、提升HDL-C水平，可顯著糾正其脂質(zhì)代謝異常從而控制常與高血糖并發(fā)的高血脂癥。結(jié)果提示EEM可能會(huì)對(duì)高血脂癥大鼠具有不錯(cuò)的治療效果。

桑椹降血糖能力的作用成分還未完全清晰，胡海梅等［8］研究顯示200、400 mg/kg劑量的桑椹多糖具有顯著降低四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖水平和一定程度增加小鼠體質(zhì)量的功效，然其降糖途徑及機(jī)理未能做深入研究。而本項(xiàng)研究表明桑椹的黃酮類(lèi)粗提物EEM具有較好的降血糖活性，EEM可以顯著提升成型糖尿病大鼠的血清胰島素水平，提示EEM可能是通過(guò)刺激胰島素分泌來(lái)實(shí)現(xiàn)其降糖作用的。此外本研究所采用的實(shí)驗(yàn)材料EEM黃酮的純度為39．82%，其降糖效率是否與桑椹黃酮純度有相關(guān)關(guān)系，還會(huì)進(jìn)一步追蹤研究。

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