外源性ADM對腎臟急性機(jī)械性損傷早期HPA軸的影響*

王曉梅， 張淑琴， 王曉燕， 王 芳， 孫少華△

(1蘭州大學(xué)第一醫(yī)院病理科，2甘肅省衛(wèi)生學(xué)校，甘肅 蘭州730000;3西安郵電學(xué)院，陜西西安710121)

腎臟受到急性創(chuàng)傷因素刺激時，腎組織局部出現(xiàn)缺血、缺氧、氧化應(yīng)激等病理生理改變，同時還可觸發(fā)創(chuàng)傷后機(jī)體一系列生理應(yīng)激反應(yīng)，尤其是下丘腦－垂體－腎上腺皮質(zhì)(hypothalamus－pituitary－adrenal cortex，HPA)軸的激活，是機(jī)體重要的防御反應(yīng)。腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin，ADM)是一種血管源性活性多肽。大量研究已證實(shí)在腎損傷及腎臟疾病中運(yùn)用外源性ADM可起到切實(shí)的腎臟保護(hù)作用[1，2]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)ADM分布于植物神經(jīng)調(diào)節(jié)中樞的相關(guān)核團(tuán)，其中在丘腦和下丘腦的含量為最高，內(nèi)源性ADM作為神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)發(fā)揮生物學(xué)作用[3－5]。在急性腎損傷過程中運(yùn)用外源性ADM，除了腎臟局部的保護(hù)作用，對機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)(HPA軸)是否也有影響，起著何種作用，尚未見有文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過建立腎損傷動物模型，進(jìn)行相關(guān)研究和探討。

材料和方法

1 動物及分組

3月齡健康清潔級Wistar大鼠104只，雌雄各半，體重(210±30)g，隨機(jī)分為4組:正常對照組8只。單純創(chuàng)傷組32只，創(chuàng)傷前給藥組32只，創(chuàng)傷后給藥組32只。后3組大鼠平均分為4批分別在機(jī)械打擊后1、6、12、24 h處死。

2 主要試劑及儀器

ADM購自Calbiochem，貨號為121703;促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)放免分析試劑盒和皮質(zhì)醇(cortisol，CORT)放免分析試劑盒均購自北京北方生物技術(shù)研究所;促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin－releasing hormone，CRH)Ⅰ抗、SABC免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;生物撞擊儀由蘭州大學(xué)第一醫(yī)院病理研究所自行研制(無專利及批準(zhǔn)，暫無型號);上海分析儀器廠生產(chǎn)的721分光光度計(jì);Beckman Coulter AllegraTM64 R低溫離心機(jī);西安二六二廠生產(chǎn)的FJ－2008型全自動γ－免疫計(jì)數(shù)儀;四川大學(xué)圖像圖形研究所Mias圖像分析系統(tǒng)。

3 ADM的配制和使用[6]

ADM使用前先用生理鹽水稀釋成50 nmol/L的母液，置于－20℃保存。實(shí)驗(yàn)時按照0.1 nmol/kg計(jì)算每只動物所需的量，再以生理鹽水稀釋為0.5 mL終體積腹腔注射即可。

4 動物腎臟創(chuàng)傷模型的建立[7]

動物不經(jīng)任何麻醉處理，采用俯臥位將其四肢固定于打擊臺上，以160 g鐵質(zhì)打擊錘從45 cm高度自由下落打擊大鼠脊肋區(qū)，打擊面為圓形，直徑1 cm，下壓距離0.7 cm。造成雙側(cè)腎臟I級損傷(根據(jù)美國創(chuàng)傷外科學(xué)會器官損傷標(biāo)準(zhǔn)委員會制定的腎臟損傷標(biāo)準(zhǔn))[8]。創(chuàng)傷前、后給藥組分別于打擊前后10 min腹腔注射ADM 0.1 nmol/kg。為避免晝夜節(jié)律的影響，各組動物均于晨8時在10%水合氯醛(3 mg/kg)深度麻醉下采用快速心臟采血法處死。

5 血漿的制備與檢測

取全血2 mL加 EDTA－Na2(1 g/L)和抑肽酶(5×108IU/L)預(yù)處理的試管中，3 000 r/min、40℃離心20 min，分離血漿，－40℃冰箱保存，由蘭州大學(xué)第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科用放免分析法檢測血漿ACTH和CORT濃度。ACTH放免分析測定盒:標(biāo)準(zhǔn)范圍5－405 ng/L，靈敏度＜5 ng/L，準(zhǔn)確性(回收率:91.7% －101.3%，平均回收率96.5%)，精密度(批內(nèi)變異系數(shù)＜6%，批間變異系數(shù)＜12%);CORT放免分析藥盒:檢測范圍為 10－500 μg/L，靈敏度 ＜2 ng/L，精密度(批內(nèi)變異系數(shù)＜10%，批間變異系數(shù)＜15%)。

6 下丘腦免疫組化

分離下丘腦(視交叉、乳頭體為前后界，左右下丘腦溝為左右側(cè)界，深約1－1.5 cm)，去除腦膜和血凝塊，10%中性甲醛固定，經(jīng)脫水、透明、包埋后，常規(guī)切片(4 μm)。采用SABC法進(jìn)行CRH免疫組化染色，DAB顯色，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性結(jié)果。采用Mias圖像分析系統(tǒng)對CRH的表達(dá)進(jìn)行面積和灰度值測量。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析及處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。各指標(biāo)均采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法。

結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)中大鼠共死亡6只:單純創(chuàng)傷組1只，創(chuàng)傷前給藥組2只，創(chuàng)傷后給藥組3只。

1 大鼠創(chuàng)傷后下丘腦CRH表達(dá)的改變

單純創(chuàng)傷組的大鼠下丘腦CRH在創(chuàng)傷后不同時點(diǎn)的表達(dá)與正常對照組相比均無顯著差異。創(chuàng)傷前注射ADM使CRH的表達(dá)在各時點(diǎn)均有所升高，其中1、24 h升高的幅度更大，與正常對照組和單純創(chuàng)傷組相比均顯著差異，6、12 h無明顯影響。創(chuàng)傷后注射ADM使CRH的表達(dá)在1、6、12 h與正常對照組和單純創(chuàng)傷組相比均顯著升高，24 h無明顯影響，見圖1。

2 大鼠創(chuàng)傷后血漿ACTH的改變

單純創(chuàng)傷組的大鼠血漿ACTH濃度在創(chuàng)傷后不同時點(diǎn)的表達(dá)與正常對照組相比均無顯著差異。創(chuàng)傷前注射ADM使大鼠血漿ACTH濃度在創(chuàng)傷后12 h明顯高于正常對照組和單純創(chuàng)傷組;在創(chuàng)傷后1 h、6 h和24 h，各組之間均無顯著差異。創(chuàng)傷后注射ADM則對各組大鼠血漿ACTH濃度均無明顯影響，任一時點(diǎn)各組之間均無顯著差異，見圖2。

Figure 1.Expression of CRH in rat hypothalamus after trauma.±s.*P ＜0.05 vs trauma group;△P ＜0.05 vs control group.圖1 大鼠創(chuàng)傷后下丘腦CRH的表達(dá)

Figure 2.Concentration of ACTH in rat plasma after trauma.±s.*P ＜0.05 vs trauma group;△P ＜0.05 vs control group.圖2 大鼠創(chuàng)傷后血漿ACTH濃度的改變

3 大鼠創(chuàng)傷后血漿CORT的改變

單純創(chuàng)傷組的大鼠血漿CORT濃度在創(chuàng)傷后不同時點(diǎn)的表達(dá)與正常對照組相比均無差異顯著。創(chuàng)傷前注射ADM使大鼠血漿CORT濃度在6、12和24 h均顯著升高，與正常對照組相比均差異顯著，而在創(chuàng)傷后12 h升高的幅度最大，與單純創(chuàng)傷組相比也有顯著差異;1 h無明顯影響。創(chuàng)傷后注射ADM則使大鼠血漿CORT濃度在12、24 h均明顯升高，與正常對照組相比均差異顯著，而在創(chuàng)傷后12 h升高的幅度最大，與單純創(chuàng)傷組相比也差異顯著;1、6 h無明顯影響，與正常對照組和單純創(chuàng)傷組相比均無顯著差異，見圖3。

討 論

1 HPA軸在急性創(chuàng)傷過程中的調(diào)節(jié)作用

Figure 3.Concentration of CORT in the rat plasma after trauma.±s.*P＜0.05 vs trauma group;△P＜0.05 vs control group.圖3 大鼠創(chuàng)傷后血漿CORT濃度的改變

本實(shí)驗(yàn)檢測了大鼠下丘腦CRH的表達(dá)、血漿ACTH、CORT的濃度，以評價大鼠腎機(jī)械性損傷后HPA軸的激活情況。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看，單純創(chuàng)傷后CRH和ACTH在12 h均有升高趨勢，但無顯著差異。CORT在創(chuàng)傷后6 h、12 h和24 h均有升高趨勢，亦無顯著差異。其主要原因可能是應(yīng)激原的強(qiáng)度不足和應(yīng)激原作用于機(jī)體的持續(xù)時間較短，不足以引起HPA軸的激活。本實(shí)驗(yàn)施加給大鼠的打擊強(qiáng)度較弱，只達(dá)到I級腎創(chuàng)傷，持續(xù)時間短暫，自由落體的打擊錘落下時打擊到作用部位，打擊錘反彈后即刻停止。這樣只能引起HPA軸輕微的活動，即CRH、ACTH和CORT在創(chuàng)傷后輕微升高但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

雖然不能得出本次實(shí)驗(yàn)中單純創(chuàng)傷后期腎組織損傷的恢復(fù)與HPA軸激活以及腎上腺皮質(zhì)激素的防御代償有關(guān)的結(jié)論，但CRH、ACTH和CORT的變化趨勢符合機(jī)體遭受創(chuàng)傷時的病理生理過程，即有一定的病理生理意義。

2 外源性ADM對HPA軸的調(diào)節(jié)作用

2.1 外源性ADM可激活HPA軸的活動 既往的研究表明中樞給予 ADM，可提高血漿 ACTH[7]以及 CORT[8]的水平;在應(yīng)激性高血壓大鼠的HPA軸檢測到ADM及其受體基因表達(dá)上調(diào)[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為:創(chuàng)傷前、后注射ADM均能使某個時點(diǎn)CRH、ACTH、CORT濃度顯著升高，即能不同程度地刺激HPA軸的各個層面，這表明外源性ADM通過其對HPA軸的各個水平的刺激作用加強(qiáng)了HPA軸的活性，在應(yīng)激激素調(diào)節(jié)和應(yīng)激生理反應(yīng)中起著一定作用，進(jìn)而發(fā)揮了對創(chuàng)傷腎組織的保護(hù)作用。

2.2 外源性ADM對HPA軸各個層面的激活作用不同 我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)外源性ADM刺激CRH、ACTH、CORT升高的時點(diǎn)不同，并且在高水平持續(xù)的時間也不相同。其對下丘腦分泌CRH和腎上腺皮質(zhì)分泌CORT的刺激作用出現(xiàn)的時點(diǎn)比較早而且持續(xù)在高水平的時間比較長，而對腺垂體分泌ACTH的刺激作用只出現(xiàn)在創(chuàng)傷前給藥組的12 h。這說明HPA軸的各個層面對外源性ADM的反應(yīng)性并不相同，即處于HPA軸兩端的下丘腦和腎上腺皮質(zhì)對ADM的反應(yīng)較敏感，而處于中間位置的腺垂體的反應(yīng)性相對較差。

2.3 創(chuàng)傷前和創(chuàng)傷后外源性ADM對HPA軸的影響不同創(chuàng)傷前10 min注射ADM，打擊腎臟時外源性ADM剛好處于半衰期之內(nèi)[10]，外源性ADM致HPA軸的興奮性增高，故出現(xiàn)傷后1 h下丘腦CRH的表達(dá)顯著增高。而該組血漿CORT濃度在6、12和24 h持續(xù)升高，一方面，CRH表達(dá)的增高，通過HPA軸，促進(jìn)靶器官CORT產(chǎn)生;另一方面是ADM發(fā)揮局部保護(hù)作用，使腎臟創(chuàng)傷初期的組織缺血缺氧減輕，從而能更好應(yīng)答應(yīng)激激素水平的調(diào)節(jié)。傷后6 h及12 h中樞CRH表達(dá)水平的回落一方面考慮是外源性ADM的消耗減少;另一方面此時點(diǎn)血漿CORT濃度的升高產(chǎn)生負(fù)反饋效應(yīng)。至創(chuàng)傷后24 h，內(nèi)源性ADM生成增加，致CRH再次升高。

創(chuàng)傷后10 min注射ADM使CRH的表達(dá)在創(chuàng)傷早期顯著增高并且持續(xù)時間較長(1 h、6 h、12 h)，一方面創(chuàng)傷后即刻的血管反應(yīng)和交感活性的增加已經(jīng)對組織造成了一定的損傷，引起HPA軸輕微的活動，并產(chǎn)生一定水平的內(nèi)源性ADM，與外源性ADM產(chǎn)生的生理效應(yīng)相疊加，促進(jìn)中樞CRH表達(dá)增加，并在創(chuàng)傷后12 h達(dá)到最高峰。創(chuàng)傷后注射的外源性ADM對已經(jīng)產(chǎn)生的組織損傷無逆轉(zhuǎn)作用，致創(chuàng)傷局部反應(yīng)減弱，因而血漿CORT水平的升高在創(chuàng)傷后期(12、24 h)才出現(xiàn)。

據(jù)此分析，創(chuàng)傷后注射ADM對下丘腦分泌CRH的激活作用更強(qiáng)，但創(chuàng)傷前注射ADM比創(chuàng)傷后注射ADM能更好刺激腎上腺皮質(zhì)分泌CORT，發(fā)揮對創(chuàng)傷腎組織的保護(hù)作用。

通過以上實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)急性腎損傷后運(yùn)用外源性ADM可活化HPA軸，提高機(jī)體的應(yīng)激防御水平，再加上其在腎臟局部的擴(kuò)血管、抗氧化、減少內(nèi)皮細(xì)胞滲漏等效應(yīng)，對創(chuàng)傷機(jī)體發(fā)揮調(diào)控和保護(hù)作用。

[1]Chao J，Chao L.The role of adrenomedullin in cardiovascular and renal function[J].Drug News Perspect，2002，15(8):511－518.

[2]黃小段，孫少華，鐘翠萍.腎上腺髓質(zhì)素的分子生物學(xué)意義及對腎臟損傷的影響[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28(20):1915 －1916.

[3]Takahashi K.Adrenomedullin from a pheochromocytoma to the eye:implications of the adrenomedullin research for endocrinology in the 21st century[J].Tohoku J Exp Med ，2001，193(2):79 －114.

[4]Serrano J，Alonso D，F(xiàn)ernandez AP，et al.Adrenomedullin in the central nervous system[J].Microsc Res Tech，2002，57(2):76 －90.

[5]畢國榮，張 輝，張賀敏，等.腎上腺髓質(zhì)素在正常大鼠大腦的分布[J].解剖科學(xué)進(jìn)展，2006，12(3):206－208.

[6]李 霞，李著華，鄒 平，等.腎上腺髓質(zhì)素在大鼠腎缺血再灌注損傷中的作用研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2003，13(6):4－ 7.

[7]蒙伶俐，孫少華，張軍榮，等.經(jīng)體表創(chuàng)傷后腎組織中HIF－1α表達(dá)的調(diào)控[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，26(14):1311－1314.

[8]Moore EE，Shackford SR，Pachter HL，et al.Organ injury scaling:spleen，liver，and kidney[J].J Trauma，1989，29(12):1664－1666.

[9]Shan J，Krukoff TL.Intracerebroventricular adrenomedullin stimulates the hypothalamus－ pituitary－ adrenal axis，the sympathetic nervous system and production of hypothalamic nitric oxide[J].J Neuroendocrinol，2001，13(11):975 －984.

[10]Beltowski J，Jamroz A.Adrenomedullin－what do we know 10 years since its discovery?[J].Pol J Pharmacol，2004，56(1):5－27.