淫羊藿苷改善糖尿病大鼠睪丸病變及其對轉(zhuǎn)化生長因子β1和Ⅳ型膠原蛋白酶表達(dá)的影響*

陳 凱， 蘇燕慧， 喻蘇青， 劉浩然， 齊敏友△

(1 浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州310014;2 湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長沙410082)

糖尿病是一種多代謝紊亂疾病，其并發(fā)癥可涉及多種器官。糖尿病所并發(fā)的生殖功能障礙是其臨床表現(xiàn)之一［1，2］，發(fā)病率是其他人群的5－10 倍，給患者的身心健康帶來嚴(yán)重的傷害。隨著糖尿病發(fā)病率的逐年上升，糖尿病并發(fā)的男性生殖功能損傷越來越受到社會的關(guān)注［3］，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。淫羊藿苷(icariin)是小檗科(Berberidaceae)淫羊藿屬(Epinedium)植物淫羊藿莖葉中提取的總黃酮(total flavonoids)的主要有效成分，分子式為C33H40O15，分子量676.67，結(jié)構(gòu)上屬于8－異戊烯基黃酮醇苷類化合物［4］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，淫羊藿苷具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能、改善心腦血管功能、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等多種藥理學(xué)作用［5］，但對糖尿病睪丸病變的作用尚未見報道。本實驗采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)大鼠1型糖尿病模型，研究淫羊藿苷對1 型糖尿病大鼠睪丸結(jié)構(gòu)和功能的影響及其可能機(jī)制，為其臨床新用途提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動物 SD 雄性健康大鼠，體重180－200 g，(浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供)。合格證號為SCXK(浙)2008－0033。

1.2 主要藥物及試劑 淫羊藿苷由西安小草植物科技有限公司提供，淡黃色粉末，純度98.25%;鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，Sigma 產(chǎn)品;考馬斯亮藍(lán)測試盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)、γ－谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ－glutamyl transpeptidase，γ－GT)和琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)試劑盒均由南京建成生物工程有限公司提供;血糖和睪酮檢測試劑盒由天津九鼎生物工程有限公司提供;兔抗大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF－β1)抗體和Ⅳ型膠原蛋白(collagen Ⅳ)由武漢博士德公司提供。

1.3 主要儀器 血糖測定儀(美國強(qiáng)生公司);紫外分光光度計、離心機(jī)(鞏義市英峪予華儀器廠);電子天平(型號104，Mettler－Toledo Group);恒溫水浴箱(型號WB22);石蠟切片機(jī)(HITACHI);Image－Pro Plus 5.0 圖像分析軟件。

2 方法

2.1 模型建立及動物分組 雄性SD 大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水。禁食12 h 后，于尾靜脈內(nèi)注射STZ，劑量為40 mg·kg－1(用0.1 mol·L－1無菌檸檬酸緩沖液配制，pH 4.6)。72 h 后抽尾靜脈血測血糖，血糖＞16.7 mmol·L－1為糖尿病大鼠模型。正常組尾靜脈內(nèi)注射同等劑量的檸檬酸緩沖液。糖尿病大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、淫羊藿苷組，每組10 只;于第4 周末開始灌胃，淫羊藿苷組以淫羊藿苷混懸液灌胃(混懸于0.5%羧甲基纖維素鈉CMC－Na);正常組及模型組每天同體積羧甲基纖維素鈉灌胃。

2.2 標(biāo)本收集與處理 實驗過程中各組均喂標(biāo)準(zhǔn)飲食，常規(guī)監(jiān)測血糖，觀察體重變化，于12 周末處死各組大鼠，心臟取血，摘取雙側(cè)睪丸，稱其總質(zhì)量，取其平均值(g)，與體質(zhì)量之比(g)，即為睪丸質(zhì)量系數(shù)(質(zhì)量系數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)。右側(cè)睪丸組織置于10%中性甲醛以制作石蠟切片，用于病理檢查，左側(cè)睪丸組織保存于液氮中。

2.3 生化指標(biāo)測定 將血標(biāo)本離心10 min(2 000 r·min－1)，取血清，按試劑盒說明測睪酮。取左側(cè)睪丸組織以生理鹽水制成勻漿，檢測SDH、ACP、γ－GT和LDH 的活性。

2.4 組織學(xué)檢測 取右側(cè)睪丸組織以10%中性甲醛固定，沿其長軸垂直于曲細(xì)精管走向剖開，經(jīng)石蠟包埋切片，HE 染色，于光鏡下觀察。

2.5 免疫組織化學(xué)染色 取各組大鼠睪丸組織石蠟包埋，4 μm 切片，烤片2 h，常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2處理清除內(nèi)源性過氧化物酶，抗原熱修復(fù)。用正常山羊血清封閉后，分別滴加兔抗大鼠TGF－β1、Ⅳ型膠原蛋白多單克隆抗體(1∶50)4℃孵育過夜。滴加Envision 工作液(武漢博士德公司，1∶50)室溫30 min。DAB 顯色，鏡下控制顯色程度后水洗。蘇木素襯染，經(jīng)二甲苯透明后中性樹膠封片。定量分析:在高倍顯微鏡下(×400)隨機(jī)選取組織結(jié)構(gòu)保存較好的精曲小管，用Image－Pro Plus 5.0 彩色病理圖像分析軟件進(jìn)行分析，測定免疫組化陽性顆粒的平均吸光度值，并計算8 個視野吸光度的均值，對TGF－β1和Ⅳ型膠蛋白表達(dá)做半定量分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 淫羊藿苷對血糖及睪丸質(zhì)量系數(shù)的影響

模型組大鼠血糖明顯高于正常組(P ＜0.01)，使用淫羊藿苷后，血糖無明顯變化，見表1。模型組大鼠體重下降，睪丸質(zhì)量系數(shù)增大，與正常組比較有顯著差異(P ＜0.01);淫羊藿苷組大鼠體重及睪丸質(zhì)量系數(shù)較模型組有所改善，睪丸質(zhì)量系數(shù)明顯降低(P ＜0.05)。

表1 淫羊藿苷對體重、血糖及睪丸質(zhì)量系數(shù)的影響Table 1. Effects of icarrin on body weight(BW)，the ratio of testis weight to body weight(TW/BW)and blood glucose(±s.n=10)

表1 淫羊藿苷對體重、血糖及睪丸質(zhì)量系數(shù)的影響Table 1. Effects of icarrin on body weight(BW)，the ratio of testis weight to body weight(TW/BW)and blood glucose(±s.n=10)

＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model.

Group BW(g) TW/BW(%) Glucose(mmol/L)Control 360.55±21.14 0.40±0.03 5.00±0.34 Model 165.33±11.15＊＊ 0.59±0.05＊＊ 19.85±3.07＊＊Icarrin 220.50±4.95## 0.44±0.06#16.37±3.94

2 淫羊藿苷對睪丸組織特異性酶SDH、ACP、γ－GT、LDH 活性及血清睪酮水平的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠睪丸中SDH、ACP、γ－GT、LDH 活性及血清睪酮水平明顯下降(P＜0.01)，而淫羊藿苷組大鼠睪丸中SDH、ACP、γ－GT、LDH 活性及血清睪酮水平較糖尿病有顯著提高(P ＜0.01)，見表2。

表2 淫羊藿苷對睪丸組織SDH、γ－GT、ACP、LDH 活性和睪酮水平的影響Table 2. Effects of icarrin on the activitiy of SDH，γ－GT，ACP and LDH and the level of testosterone in testicular tissues(±s.n=10)

表2 淫羊藿苷對睪丸組織SDH、γ－GT、ACP、LDH 活性和睪酮水平的影響Table 2. Effects of icarrin on the activitiy of SDH，γ－GT，ACP and LDH and the level of testosterone in testicular tissues(±s.n=10)

＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs diabetic.

Group SDH(U·g －1 protein)γ－GT(U·g －1 protein)ACP(U·g －1 protein)LDH(U·g －1 protein)Testosterone(nmol·L －1)Control 29.92 ±4.72 51.50 ±6.74 101.23 ±17.38 4 005.42 ±600.70 33.88 ±2.61 Model 15.51 ±2.97＊＊ 27.47 ±8.07＊＊ 63.05 ±13.30＊＊ 2 832.64 ±428.32＊＊ 17.11 ±2.12＊＊Icarrin 25.18 ±4.21## 45.15 ±3.31## 89.72 ±14.76## 3 846.64 ±589.21## 23.49 ±2.55##

3 睪丸組織形態(tài)學(xué)改變

正常組小鼠睪丸各級生精細(xì)胞豐富，生精細(xì)胞與支持細(xì)胞排列有序;模型組睪丸各級生精細(xì)胞顯著減少，支持細(xì)胞少，甚至成空泡，細(xì)胞排列紊亂。淫羊藿苷組生精細(xì)胞相對模型組增多，排列較為整齊，與正常組較為接近，見圖1。

Figure 1. Pathological changes of rat testicular tissues from control (A)，model (B)，icarrin (C)groups (HE staining，×100).圖1 各組大鼠睪丸組織病理比較

4 睪丸組織中TGF－β1 和Ⅳ型膠原蛋白的變化

淫羊藿苷對大鼠生殖細(xì)胞TGF－β1和Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)的觀察結(jié)果見圖2、3。TGF－β1和Ⅳ型膠原蛋白陽性表達(dá)主要見于圓形精子細(xì)胞以及支持細(xì)胞的胞質(zhì)。與正常對照組比較，模型組表達(dá)顯著增加(P ＜0.01)，淫羊藿苷組的表達(dá)與模型組比較明顯降低(P ＜0.01，P ＜0.05)。

討 論

對于糖尿病及其并發(fā)癥的動物模型的建立方法有多種，到目前為止，大部分對糖尿病睪丸組織病理變化的研究通常使用STZ 誘導(dǎo)的動物模型［6］。STZ為一種廣譜抗菌素，能特異性破壞胰島β 細(xì)胞，導(dǎo)致胰島素分泌減少，血糖升高。本研究證實，經(jīng)STZ 溶液(40 mg·kg－1)一次性尾靜脈注射方法制備大鼠糖尿病模型［7］，模型組和用藥組大鼠的血糖均＞16.7 mmol/ L，多飲、多尿、多食、少重的“三多一少”癥狀明顯，24 h 尿量大于原尿量50%，顯示本研究中糖尿病睪丸病變模型是成功的。

糖尿病導(dǎo)致的睪丸功能和結(jié)構(gòu)的損傷可以表現(xiàn)為其標(biāo)志性酶類的變化［8］。睪丸中標(biāo)志性酶ACP其活性的高低可作為衡量是否有生精障礙的指標(biāo)，SDH 在精子能量代謝中起重要作用，LDH 促進(jìn)能量代謝及生精上皮成熟，而γ－GT 則為精子成熟提供酸性環(huán)境［9］。本實驗研究結(jié)果顯示，STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠功能明顯損害。模型組睪丸系數(shù)顯著下降，睪丸特異性酶類活性的減弱。另外，病理組織學(xué)顯示曲細(xì)精管明顯減少，支持細(xì)胞少，甚至成空泡。淫羊藿苷組對上述表現(xiàn)都有不同程度的逆轉(zhuǎn)，提示淫羊藿苷可以保護(hù)酶的活性，防止各級生精細(xì)胞的損傷，促進(jìn)生精細(xì)胞能量的生成，從而對糖尿病模型大鼠睪丸有保護(hù)作用。

Figure 2. Expression of TGF－β1 in testicular tissues of rats(immunohistochemical staining，×400).A:control;B:model;C:icarrin. ±s.n=8. ＊＊P ＜0.01 vs A;##P ＜0.01 vs B.圖2 睪丸組織TGF－β1 的表達(dá)

Figure 3. Expression of collagen Ⅳin testicular tissues of rats(immunohistochemical staining，×400).A:control;B:model;C:icarrin.±s.n=8. ＊＊P ＜0.01 vs A;#P ＜0.05 vs B.圖3 睪丸組織Ⅳ型膠原蛋白的表達(dá)

對生殖系統(tǒng)來講，睪酮水平在刺激性器官分化、發(fā)育并維持正常性功能方面均起重要作用［10］，睪酮促使精子發(fā)生和成熟，糖尿病可以使睪丸逐步出現(xiàn)病變，睪酮分泌減少，本實驗中糖尿病模型大鼠血清睪酮明顯減少，淫羊藿苷能在一定程度上恢復(fù)睪丸功能，促進(jìn)睪酮分泌，進(jìn)一步證明淫羊藿苷對糖尿病及其并發(fā)的性與生殖功能障礙有防治作用。

TGF－β1是糖尿病并發(fā)癥發(fā)展過程中起重要作用的一類生長因子［11］，表達(dá)于各種哺乳動物的睪丸中，與睪丸的生理功能密切相關(guān)。一些體內(nèi)外研究中對糖尿病睪丸的保護(hù)藥物往往以此為評價，睪丸發(fā)病過程中各種損傷介質(zhì)最終是通過誘導(dǎo)TGF－β1增加致睪丸損害。另外，TGF－β1能誘導(dǎo)基質(zhì)蛋白的沉積［12］，同時刺激睪丸界膜中主要的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)分子Ⅳ型膠原蛋白的表達(dá)和產(chǎn)生［13］。Ⅳ型膠原作為ECM 的主要組分，構(gòu)成睪丸基膜的結(jié)構(gòu)支架，是ECM 增殖的主要成分。本研究免疫組化結(jié)果顯示模型組TGF－β1及Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)顯著升高，與模型組相比，淫羊藿苷組TGF－β1及Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)明顯減少。這提示淫羊藿苷最終是通過下調(diào)TGF－β1與Ⅳ型膠原途徑發(fā)揮其睪丸保護(hù)作用，但其作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究表明，淫羊藿苷對糖尿病大鼠睪丸具有一定的保護(hù)作用，機(jī)制可能與其促進(jìn)睪酮分泌、抑制TGF－β1和Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)有關(guān)。由于目前對糖尿病睪丸病變?nèi)狈τ行е委熓侄?，因此積極研究淫羊藿苷治療糖尿病睪丸病的作用和機(jī)制具有重要意義。

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