NAD(P)H:醌氧化還原酶1對多巴胺能細(xì)胞的保護(hù)作用*

王 艷， 王 娜， 俞國華， 袁崇剛

(華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200062)

已知帕金森病(Parkinson disease，PD)的主要病因源于黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的死亡，迄今為止對PD患者多巴胺神經(jīng)元死亡特異性與漸進(jìn)性的問題仍沒有完全解決。大量證據(jù)表明多巴胺神經(jīng)元死亡的機(jī)制涉及到遺傳學(xué)和環(huán)境相結(jié)合的復(fù)雜因素，即:(1)線粒體功能障礙;(2)炎癥過程;(3)氧化應(yīng)激;(4)蛋白代謝異常。其中，多巴胺能神經(jīng)元特異性氧化應(yīng)激引起了人們的高度關(guān)注[1，2]。

在氧化環(huán)境下，多巴胺可以被氧化形成多巴胺醌。細(xì)胞內(nèi)的NAD(P)H[nicotinamide adenine dinucleotide(phosphate)]依賴還原型輔酶Ⅰ/Ⅱ:醌氧化還原酶[NAD(P)H:quinone oxidoreductase，NQO1]，又稱D2硫辛酰胺脫氫酶(DT－diaphorase)，以NAD(P)H為受體，催化醌類及其衍生物，使其失去2個電子，發(fā)生還原反應(yīng)，其催化特性在于無單電子還原產(chǎn)物半醌及自由基等氧化產(chǎn)物形成，避免了對細(xì)胞的損傷。NQO1與其它Ⅰ、Ⅱ相代謝酶一起構(gòu)成了體內(nèi)對外源毒性物質(zhì)的代謝網(wǎng)絡(luò)，在機(jī)體的解毒代謝中發(fā)揮著重要作用[3]。

有實(shí)驗(yàn)證明，Ⅱ相酶誘導(dǎo)劑蘿卜硫素(sulforaphane，SF)在動物機(jī)體的各個組織器官內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅱ相代謝酶，如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione transferase，GST)和NQO1。Ⅱ相代謝酶可消除有害化學(xué)物質(zhì)，抑制其損傷DNA，從而達(dá)到抗癌癥效果[4]。有研究表明，NQO1是一種可誘導(dǎo)的還原酶，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)醌類物質(zhì)含量升高時，NQO1表達(dá)量將會有所增加[5]。NQO1的還原性能夠保護(hù)細(xì)胞不被自然界中的醌類等生物異源性物質(zhì)損傷[6，7]。在多巴胺細(xì)胞內(nèi)，多巴胺可以被氧化形成反應(yīng)性的醌，多巴胺醌可以和蛋白質(zhì)半胱氨?；鶊F(tuán)上的巰基結(jié)合，形成醌化蛋白，進(jìn)而影響蛋白的正常功能[8]。NQO1在多巴胺的自動氧化過程中有保護(hù)和抗氧化作用，因而我們認(rèn)為NQO1應(yīng)對多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們運(yùn)用MTT方法檢測了DA對多巴胺能細(xì)胞活性的影響及與醌蛋白形成的相關(guān)性，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法使細(xì)胞內(nèi)NQO1過表達(dá)，并用免疫熒光及免疫印跡法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，繼而再運(yùn)用MTT方法檢測DA對NQO1過表達(dá)細(xì)胞的活性影響。我們的結(jié)果揭示了NQO1與多巴胺代謝的關(guān)系，并為帕金森病發(fā)病機(jī)制的研究以及對帕金森病防治提供了新線索。

材料和方法

1 材料

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH－SY5Y購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫;DMEM/F12培養(yǎng)基均為Gibco產(chǎn)品;新生小牛血清(newborn calf serum，NBCS)為Bio West產(chǎn)品。MTT試劑為上海生博公司產(chǎn)品;多巴胺(dopamine，DA)為Sigma產(chǎn)品;NQO1抗體為Sigma產(chǎn)品;SF為LKT Laboratories產(chǎn)品。β－tubulin抗體為Millipore產(chǎn)品;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑GenJetTMin vitro DNA Transfection Reagent為 SignaGen Laboratories產(chǎn)品。氯化硝基四氮唑藍(lán)檢測試劑盒為碧云天產(chǎn)品;蛋白濃度測定試劑盒為Bio－Rad產(chǎn)品;紅外熒光Ⅱ抗為Odyssey產(chǎn)品。免疫熒光Ⅱ抗Alexa Fluor 594 goat anti－rabbit IgG為Invitrogen產(chǎn)品。

2 方法

2.1 SH－SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)方法 SH－SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%新生牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中有氧條件下培養(yǎng)[9]。

2.2 細(xì)胞增殖分析 SH－SY5Y細(xì)胞以3×104cells/well的密度分別接種于24孔板，培養(yǎng)24 h后，加以不同濃度DA，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液并加入新鮮培養(yǎng)液，于每孔加入50 μL MTT溶液(5 g/L)，在37℃培養(yǎng)箱中孵育3 h，倒去培養(yǎng)液，每孔加入 200 μL 二甲亞砜 (dimethyl sulfoxide，DMSO)，結(jié)晶溶解后將24孔板中的200 μL溶液吸入3個96孔板中，多功能酶標(biāo)儀檢測570 nm下的吸光度值。NQO1誘導(dǎo)劑SF在細(xì)胞種板后2 h加入，然后再過24 h加入DA，測法同前。

加藥方法如下:DA濃度分別為200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L、800 μmol/L、1 000 μmol/L 5 種濃度，每種濃度2個平行孔(24孔板)進(jìn)行加藥。

2.3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 接種細(xì)胞入10 cm培養(yǎng)皿使其長至80%－90%，轉(zhuǎn)染前1 h換上新鮮的完全細(xì)胞培養(yǎng)液，4個EP管中各加入250 μL DMEM高糖無血清培養(yǎng)基，其中2個EP管中加入12 μL Transfection Reagent，另2個 EP管分別加入4 μg pCB6和4 μg NQO1質(zhì)粒，然后將含有 Transfection Reagent的培養(yǎng)基迅速加入含有質(zhì)粒的EP管中，輕輕打勻，室溫培養(yǎng)約15 min，最后將其加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)12－18 h后換上新鮮完全細(xì)胞培養(yǎng)液，然后加藥或進(jìn)行其它實(shí)驗(yàn)。

2.4 SH－SY5Y細(xì)胞的免疫熒光檢測 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)NQO1蛋白的表達(dá)情況。將細(xì)胞按104cells/well種于24孔板中，以4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3×5 min。加封閉劑于37℃中孵育1 h，吸去封閉劑，加入NQO1抗體(1∶500)，于4℃過夜。PBS漂洗3×5 min，加CY3標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗(1∶100)孵育1 h，PBS 漂洗3 ×5 min，再加入核染料 DAPI(4'，6 －diamidino－2－phenylindole)孵育15 min，PBS漂洗3×5 min。熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2.5 Western blotting檢測 細(xì)胞裂解抽提蛋白，通過 SDS/PAGE 電泳(50 μg 蛋白/孔)，80 V 電壓30 min，120V電壓1 h 15 min，剝膠后 100V電轉(zhuǎn)1 h 15 min，Odyssey封閉液封閉1 h，使用以下抗體:兔抗 NQO1(1∶5 000)，鼠抗 β －tubulin(1∶1 000)，4℃振蕩孵育過夜。0.5‰ TBST洗膜3×5 min。OdysseyⅡ抗[抗兔(綠1∶1 000)，抗鼠(紅1∶1 000)]室溫孵育1 h，0.5‰ TBST洗膜3×5 min，PBS洗膜5 min，Odyssey儀器檢測條帶。

2.6 醌蛋白檢測 運(yùn)用硝基四氮唑藍(lán)(nitroblue tetrazolium，NBT)檢測細(xì)胞內(nèi)醌蛋白含量的變化。提取蛋白后，蛋白溶液中加入5倍體積的丙酮沉淀蛋白，室溫放置2 h，3 000×g離心10 min，蛋白沉淀用Guan－HCl溶液(6 mol/L Guan HCl，10 mmol/L Tris HCl，100mmol/L NaH2PO4，pH 8.0)溶解。BCA 蛋白定量后，每 100 μg 樣品與 600 μL NBT/甘氨酸溶液(0.24 mmol/L NBT，2 mol/L 甘氨酸，pH 10)混合，避光搖床反應(yīng)1 h，酶標(biāo)儀測定530 nm處的吸光度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SigmaPlot 10.0軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。單變量配對資料之間的比較采用配對樣本t檢驗(yàn)。多組間采用單因素方差分析。

結(jié) 果

1 MTT檢測DA對細(xì)胞的毒性影響，以及NBT檢測DA處理后細(xì)胞內(nèi)醌化蛋白的量

MTT結(jié)果顯示，DA對細(xì)胞的毒性影響呈現(xiàn)劑量依賴性，隨著DA濃度的升高對細(xì)胞的毒性越強(qiáng)，見圖1A，NBT方法檢測顯示細(xì)胞經(jīng)DA處理后，細(xì)胞內(nèi)醌化蛋白含量顯著上升，見圖1B。

2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NQO1可以減輕DA對細(xì)胞的影響

圖2顯示:(1)免疫熒光和免疫印跡法結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染NQO1表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)NQO1表達(dá)量增高，見圖2A、B;(2)MTT結(jié)果表明DA對轉(zhuǎn)染NQO1質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCB6+的細(xì)胞活性影響有明顯差別，轉(zhuǎn)染NQO1對DA造成的細(xì)胞毒性具有顯著的緩解作用，見圖2C。與此同時，NQO1脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染使細(xì)胞內(nèi)NQO1過表達(dá)后，胞內(nèi)醌化蛋白含量也相應(yīng)減少，見圖2D。(圖中出現(xiàn)的2條綠色條帶，可能是由于非特異性的染色，對于出現(xiàn)的原因在之后的實(shí)驗(yàn)會繼續(xù)探討這個問題。)

3 SF預(yù)處理可降低DA對細(xì)胞的毒性影響

結(jié)果表明:(1)細(xì)胞經(jīng)SF誘導(dǎo)后，可以緩解DA對其造成的細(xì)胞毒性影響，見圖3A;(2)免疫印跡法檢測結(jié)果表明細(xì)胞經(jīng)DA、SF處理后細(xì)胞內(nèi)NQO1表達(dá)量增高，并且DA和SF共同作用使得NQO1表達(dá)量進(jìn)一步提高，見圖3B;(3)加入Ⅱ相酶誘導(dǎo)劑SF使細(xì)胞內(nèi)NQO1過表達(dá)后，胞內(nèi)醌化蛋白含量減少，見圖3C。

Figure 1.DA treatment reduced cell proliferation(A)and increased quinone protein formation(B).SH －SY5Y cells were subject to DA(200 μmol/L，400 μmol/L，600 μmol/L，800 μmol/L，or 1 000 μmol/L)treatment for 24 h.±s.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L DA group.圖1 MTT檢測DA對細(xì)胞的毒性影響及NBT檢測胞內(nèi)醌化蛋白的變化

Figure 2.NQO1 overexpression reduced the toxicity caused by DA in SH －SY5Y cells.A:immunofluorescent staining of NQO1 in SH－SY5Y cells.Cells transfected with an pCB6(left)or NQO1－pCB6(right)plasmids were stained with an anti－NQO1 antibody;B:the level of NQO1 expression was determined by Western blotting with an anti－NQO1 antibody;C:Cells transfected with pCB6 or NQO1－pCB6 plamids were treated with DA for 24 h;D:the content of quinone ptotein was determined by NBT assay.±s.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs pCB6 group.圖2 檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)NQO1的變化情況及轉(zhuǎn)染后DA對細(xì)胞的毒性作用

Figure 3.Cell proliferation and NQO1 expression in SF－treated SH－SY5Y cells.A:SF protected cells from DA－induced cytotoxicity;B:NQO1 expression was determined by Western blotting with an anti－NQO1 antibody;C:the content of quinone protein in DA and/or SF－treated cells.±s.n=6.＊＊P＜0.01 vs 600 μmol/L DA;△△P ＜0.01 vs 400 μmol/L DA.圖3 SF預(yù)處理細(xì)胞后胞內(nèi)NQO1的表達(dá)情況及SF誘導(dǎo)后DA對細(xì)胞的毒性影響

討 論

有研究報(bào)道Ⅱ相酶誘導(dǎo)劑SF能夠保護(hù)多巴胺能細(xì)胞不受多巴胺神經(jīng)毒性劑6－羥多巴胺(6－h(huán)ydrodopamine，6－OHDA)和四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)的毒性損傷，這些毒性劑會使細(xì)胞產(chǎn)生醌類物質(zhì)，引起細(xì)胞內(nèi)氧化環(huán)境發(fā)生變化，從而引起細(xì)胞選擇性死亡。SF的這種保護(hù)作用很可能是由細(xì)胞內(nèi)醌類物質(zhì)所介導(dǎo)，因?yàn)镾F作用后，醌氧化還原酶的活性和mRNA提高，而細(xì)胞內(nèi)醌修飾的蛋白降低，同時SF預(yù)處理會減輕BH4引起的細(xì)胞內(nèi)活性氧的上升，DNA片段化和脂膜的破壞，這些研究說明SF能夠保護(hù)多巴胺能細(xì)胞[10]。

DA在正常情況是一種神經(jīng)遞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中和囊泡內(nèi)都有分布，但主要是聚集在囊泡中，執(zhí)行神經(jīng)遞質(zhì)的功能。在細(xì)胞質(zhì)中，DA會自氧化或是被酶催化氧化形成多巴胺醌，與細(xì)胞內(nèi)蛋白結(jié)合使之失活，進(jìn)而造成細(xì)胞損傷。細(xì)胞質(zhì)中的多巴胺量的增多是多巴胺神經(jīng)元丟失的原因。有實(shí)驗(yàn)表明DA衍生的醌是作為一個媒介調(diào)節(jié)蛋白的活性，由于醌缺失電子具有高親核性，對低電位的分子具有很高的反應(yīng)性，會競爭結(jié)合蛋白硫醇基上，從而會引起細(xì)胞內(nèi)蛋白和 DNA 的毒性[11]。

實(shí)驗(yàn)開始首先用MTT方法證明了DA對細(xì)胞的劑量依賴性毒性影響。為了研究醌化蛋白與DA造成的細(xì)胞毒性的關(guān)系，我們用NBT方法檢測了DA處理后細(xì)胞內(nèi)醌化蛋白的含量，結(jié)果表明醌化蛋白的含量與DA的細(xì)胞毒性具有相關(guān)性。細(xì)胞內(nèi)醌氧化還原酶可以還原醌，從而阻止醌化蛋白的產(chǎn)生，因此本實(shí)驗(yàn)對NQO1醌氧化還原酶的作用進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法使細(xì)胞內(nèi)的NQO1過表達(dá)，繼而運(yùn)用免疫熒光化學(xué)、免疫印跡法方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染的效果，確定細(xì)胞內(nèi)NQO1蛋白高表達(dá);在細(xì)胞內(nèi)NQO1過表達(dá)之后再用DA作用于細(xì)胞，運(yùn)用MTT方法檢測DA對細(xì)胞活性的影響。與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對照組相比，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染NQO1表達(dá)質(zhì)粒后使得DA對細(xì)胞的增殖影響有顯著的緩解作用，并且轉(zhuǎn)染NQO1表達(dá)質(zhì)粒使細(xì)胞內(nèi)NQO1過表達(dá)后，DA處理引起的細(xì)胞內(nèi)醌化蛋白的含量也有所降低。由于NQO1是一種可誘導(dǎo)的還原酶，我們用Ⅱ相酶誘導(dǎo)劑SF預(yù)處理細(xì)胞，并運(yùn)用免疫印跡法驗(yàn)證了細(xì)胞內(nèi)NQO1的表達(dá)量提高。隨后，我們檢測了SF預(yù)處理對DA細(xì)胞毒性的影響，結(jié)果表明SF誘導(dǎo)可減輕DA對細(xì)胞的毒性，并降低細(xì)胞內(nèi)醌化蛋白的含量。

我們的實(shí)驗(yàn)說明DA對細(xì)胞增殖影響與細(xì)胞內(nèi)醌化蛋白的含量有一定關(guān)系，此外，細(xì)胞內(nèi)醌氧化還原蛋白NQO1的高表達(dá)可以有效減輕細(xì)胞內(nèi)醌化蛋白對細(xì)胞的影響，繼而減輕DA對細(xì)胞的毒性。帕金森病的主要病理變化是多巴胺能細(xì)胞的特異性損傷，其中多巴胺的毒性作用多巴胺能細(xì)胞的特異性丟失具有重要作用[12]，所以降低多巴胺醌的形成、減輕醌化蛋白對DA能細(xì)胞的損傷對進(jìn)一步研究和治療帕金森病具有一定的意義。

[1]郝 斌，周曉平.帕金森病發(fā)病機(jī)制的研究[J].中國藥物與臨床，2004，4(7):525 －527.

[2]張 偉，楊 輝.6－OHDA制作帕金森病大鼠模型及評估[J].四川醫(yī)學(xué)，2007，28(8):818 －820.

[3]代恩勇，盧振霞.NQO1與腫瘤[J].國外醫(yī)學(xué):遺傳學(xué)分冊，2003，26(3):141 －144.

[4]Zhang Y，Talalay P，Cho CG，et al.A major inducer of anticarcinogenic protective enzymes from broccoli:Isolation and elucidation of structure[J].Proc Natl Acad Sci USA，1992，89(3):2399－2403.

[5]夏小俊，金中初.NQO1酶及其被氧環(huán)境誘導(dǎo)表達(dá)的研究進(jìn)展[J].生理科學(xué)進(jìn)展，2002，23(3):225－229.

[6]Traver RD，Horikoshi T，Danenberg KD，et al.NAD(P)H:quinone oxidoreductase gene expression in human colon carcinoma cells:characterization of a mutation which modulates DT－diaphorase activity and mitomycin sensitivity[J].Cancer Res，1992，52(4):797－802.

[7]Siegel D，Ross D.Immunodetection of NAD(P)H:quinine oxidoreductase(NQO1)in human tissues[J].Free Radic Biol Med，2000，29(3－4):246－253.

[8]Gudelsky GA，Yamamoto BK，Nash JF.MDMA increases the extracellular concentration of 2，3 － dihydroxybenzoic acid in the striatum:evidence for increased hydroxyl radical formation[J].Soc Neurosci Abstr，1994，20(2):1026－1034.

[9]陳 瑛，竺飛燕，王 煉，等.DMT1在多巴胺能神經(jīng)元變性中的作用研究[J].中國病理生理雜志，2011，27(2):350－356.

[10]Han JM，Lee YJ，Lee SY，et al.Protective effect of sulforaphane against dopaminergic cell death[J].J Pharmacol Exp Ther，2007，321(1):249 －256.

[11]Mosharov EV，Larsen KE，Kanter E，et al.Interplay between cytosolic dopamine，calcium，and α － synuclein causes selective death of substantia nigra neurons[J].neuron，2009，62(2):218－229.

[12]Kuhn DM，Arthur R Jr.Dopamine inactivates tryptophan hydroxylase and forms a redox－cycling quinoprotein:possible endogenous toxin to serotonin neurons[J].J Neurosci，1998，18(18):7111－7117.