MT1－MMP基因敲除細胞的誘導多能干細胞系的構建*

王彥霞， 馬 玲， 馬海英， 魏文娟， 盧曉梅， 金玉楠， 于艷秋

(中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理生理教研室，遼寧沈陽110001)

誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)是一類新型的干細胞，它有著與胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)相同的特征，具有自我更新、無限增殖以及向3個胚層分化的能力。ESCs屬于全能干細胞，是來源于哺乳類動物囊胚的內(nèi)細胞團，具有無限增殖而保持其多能性的能力，尤其在特定因素的影響或誘導下，可向多種細胞或組織分化[1，2]。通過將核轉(zhuǎn)移到卵母細胞中[3]或成體細胞與ESCs相融合[4]，使成體細胞重新編程為具有多能性的細胞。但無論是ESCs還是重新編程的細胞在移植到病人體內(nèi)都會發(fā)生免疫排斥反應，并且在獲得ESCs時，不免會產(chǎn)生損壞胚胎的道德問題。最早建立iPSCs系是在2006年，研究人員利用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導，將Oct3/4、Sox2、c－Myc及Klf4四個外源基因轉(zhuǎn)入鼠成纖維細胞中，使成體細胞重新編程為具有多向分化潛能的干細胞，并命名該類細胞為 iPSCs[5，6]。在 2007年，美國Thomson實驗室首次用Oct4、Sox2、Nanog及Lin28 4個基因轉(zhuǎn)染，將人成纖維細胞重新編程為iPSCs[7]。到目前為止，國內(nèi)外許多實驗室完成了多種類型成體細胞向iPSCs的重新編程，同時iPSCs也可向多種組織類型細胞分化，如iPSCs能夠定向分化為胰島素分泌細胞、神經(jīng)細胞、肝細胞和心肌細胞[8－11]等。膜型基質(zhì)金屬蛋白酶(membrane－type matrix metalloproteinases，MT－MMPs)可降解各種細胞外基質(zhì)，通過控制細胞的黏附和細胞骨架的構建，調(diào)節(jié)細胞的遷移、生長、分化和存活[12]。它們依靠疏水性的C－末端錨定在細胞膜上，在細胞表面發(fā)揮水解作用[13]。MT1－MMP是最先被發(fā)現(xiàn)而且是最重要的，又稱為MMP－14。MT1－MMP在血管與軟骨、骨的形成中起著主要作用，特別是腫瘤中的血管?；罨腗T1－MMP能降解細胞外各種基質(zhì)大分子，包括Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型膠原、纖連蛋白、纖維蛋白等。在血管的形成過程中，內(nèi)皮細胞首先侵入到主要由Ⅰ型膠原組成的間質(zhì)性基質(zhì)中，細胞外基質(zhì)降解酶包括基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)在血管的形成中都起著重要作用，它們與細胞表面的結(jié)合位點結(jié)合后，依賴纖溶酶過程和/或MT1－MMP過程激活后而發(fā)揮作用。本實驗是用轉(zhuǎn)基因的方法將逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的Oct3/4、Sox2、c－Myc及Klf4四個外源基因轉(zhuǎn)入正常和MT1－MMP基因缺失鼠成纖維細胞中，使之重新編程為iPSCs，有利于我們進一步對MT1－MMP基因和iPSCs作用的研究。

材料和方法

1 材料

1.1 細胞來源 pMXs－Oct3/4、－Sox2、－c－Myc和 －Klf4質(zhì)粒，Plat－ E 包裝細胞系，F(xiàn)bx15βgeo/βgeo鼠成纖維細胞，MT1 －MMP基因敲除鼠成纖維細胞和SNL飼養(yǎng)細胞等均由香港大學周中軍教授饋贈。

1.2 主要試劑 DMEM(低糖)、胎牛血清(FBS)、0.25%trypsin－EDTA、L－谷氨酰胺、非必需氨基酸、青鏈霉素、OPTI－MEM、IMDM心肌誘導培養(yǎng)基和β－巰基乙醇均購自Gibco。羊抗鼠Flk－1/KDR多克隆抗體、rHuVEGF165和rHubFGF購自 R＆D Systems Inc.。PBS購自福州邁新公司。Lipofectamine 2000和DNA質(zhì)粒提取試劑盒均購自Invitrogen。海美溴氨購自Sigma。明膠購自華美生物公司。鼠抗鼠或人SSEA－1單克隆抗體購自BioLegend。鼠抗鼠或人Oct3/4單克隆抗體、兔抗鼠troponin I多克隆抗體、山羊抗小鼠IgGPE、山羊抗兔IgG－PE和兔抗山羊 IgG－PE均購自 Santa Cruz。堿性磷酸酶試劑盒和DAPI均購自江蘇碧云天公司。

2 方法

2.1 細胞準備 從液氮中各取出1管SNL、Plat－E、WT和MT1－MMP基因敲除細胞，放入37℃水浴鍋中，使之快速解凍，然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞轉(zhuǎn)移到提前鋪好明膠的60 mm培養(yǎng)皿中，放在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，等細胞長到約80% －90%融合進行傳代。SNL細胞用絲裂霉素處理后，作為飼養(yǎng)細胞;Plat－E用于包裝pMXs－Oct3/4、－Sox2、－c－Myc和－Klf4 4種質(zhì)粒;WT和MT1－MMP基因敲除細胞準備被轉(zhuǎn)染。

2.2 質(zhì)粒擴增和包裝成病毒 將分別攜帶有pMXs－Oct3/4、－Sox2、－c－Myc和－Klf4 4種質(zhì)粒的大腸桿菌，加入到LB培養(yǎng)基中放入37℃搖床中過夜，第2 d用DNA提取試劑盒按說明書提取pMXs－Oct3/4、－Sox2、－c－Myc和－Klf4 4種質(zhì)粒。

2.3 細胞轉(zhuǎn)染 Plat－E包裝細胞系傳代后，以密度8×108cells/L細胞數(shù)接種于100 mm的培養(yǎng)皿中，加入OPTIMEM、Lipofectamine 2000和含有 pMXs－Oct3/4、－Sox2、－c－Myc和－Klf4的質(zhì)粒過夜，第2 d 20 mL注射器吸取上清液，用0.45 μm濾器將上清液過濾到15 mL離心管中，再加入10 μL 8 g/L的海美溴氨。傳代后的WT和MT1－MMP基因敲除細胞以密度8×107cells/L細胞數(shù)接種于100 mm的培養(yǎng)皿中，加入 pMXs－Oct3/4、－Sox2、－c－Myc和 －Klf4質(zhì)粒包裝成病毒的上清液，放入37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，第2 d再轉(zhuǎn)染1次，每天換液，2 d后傳到鋪有飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)皿中，隔天換液。

2.4 iPSCs的鑒定

①光鏡下觀察形態(tài)變化 在光學倒置顯微鏡下觀察WT和MT1－MMP基因敲除細胞形態(tài)和轉(zhuǎn)染后的克隆形成情況。當克隆足夠大時，采集克隆，將克隆細胞傳代，觀察傳代后iPSCs的形態(tài)。

②堿性磷酸酶染色 按堿性磷酸酶試劑盒說明書進行操作，將iPSCs以3×107cells/L密度接種于35 mm的培養(yǎng)皿中，第2 d棄去培養(yǎng)基，PBS洗2遍。4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3遍(每遍5 min)，加入堿性磷酸酶染色液，10 min后顯微鏡下觀察拍照。

③免疫細胞化學染色 iPSCs用免疫細胞化學染色法檢測ESCs特異性標志SSEA－1和Oct3/4表達情況。將iPSCs棄去培養(yǎng)基，PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3遍(每遍5 min)。0.2%Triton X－100打孔30 min，PBS洗3遍。5%FBA封閉樣本20 min，滴加Ⅰ抗，置于濕盒，4℃孵育過夜，第2 d PBS洗3遍。滴加Ⅱ抗，37℃孵育30 min，PBS洗3遍。DAPI染核4 min，PBS洗3遍熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.5 體外iPSCs誘導分化和鑒定 用含20%FBS的IMDM心肌細胞誘導分化培養(yǎng)基，以及含有50 μg/L rHuVEGF和10 μg/L rHubFGF的內(nèi)皮細胞分化培養(yǎng)基，iPSCs以密度8×107cells/L應用懸滴法(“hanging drop”)培養(yǎng)，即將細胞懸液以20 μL/滴，接種于盛有10 mL PBS的100mm培養(yǎng)皿的皿蓋上，置37℃、5%CO2的孵箱中懸滴培養(yǎng)4 d后，iPSCs形成肉眼可見大小均一的擬胚體(embryonic bodys，EBs)。從單個懸滴中吸出形成的懸浮EBs，轉(zhuǎn)入至預先以0.1%明膠包被的24孔培養(yǎng)板中(1－2個/孔)，隔天換1次新鮮誘導液，放入37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。分化約12 d后，向心肌細胞分化的一些EBs中，出現(xiàn)有節(jié)律跳動的心肌合胞體。心肌細胞出現(xiàn)跳動后，用免疫細胞化學染色法分別檢測心肌細胞特異性標志物肌鈣蛋白I和內(nèi)皮細胞特異性標志物Flk－1表達情況。

結(jié) 果

1 WT和MT1－MMP基因敲除鼠成纖維細胞和Plat－E細胞形態(tài)

從液氮中各取出1管WT和MT1－MMP基因敲除鼠成纖維細胞和Plat－E細胞，快速解凍后，將這些細胞轉(zhuǎn)移到提前鋪好明膠的60 mm培養(yǎng)皿中，細胞長到約80% －90%融合后傳代培養(yǎng)，可見2種成纖維細胞呈長梭形，見圖1A、B，以及Plat－E細胞，見圖1C。

Figure 1.The morphology of WT(A)，MT1－MMP－deficient(B)mouse fibroblasts and Plat－E cells(C)(×200).圖1 WT和MT1－MMP基因敲除鼠成纖維細胞和Plat－E細胞形態(tài)

2 ESCs樣克隆形成、iPSCs形態(tài)和堿性磷酸酶染色

在光學倒置顯微鏡下觀察WT和MT1－MMP基因敲除細胞形態(tài)和轉(zhuǎn)染后的克隆形成情況，可見有明顯的ESCs樣克隆形成，見圖2A、D。當克隆足夠大時，采集克隆，將克隆細胞傳代，觀察傳代后iPSCs的形態(tài)，傳代的iPSCs種在飼養(yǎng)細胞上，iPSCs與ESCs相似，呈集落式生長，見圖2B、E。將傳第3代的iPSCs進行堿性磷酸酶染色觀察，可見iPSCs被堿性磷酸酶染成藍紫色，見圖2C、F。

Figure 2.The morphology of ESC－like clone(A，D)(×100)，iPSCs(B，E)(×200)and AP staining(C，F(xiàn))(×200).A，B，C and D，E，F(xiàn):cells derived from WT and MT1－MMP－deficient mouse fibroblasts，respectively.圖2 ESCs樣克隆形成、iPSCs形態(tài)和堿性磷酸酶染色

3 用免疫細胞化學染色檢測ESCs特異性標志物SSEA－1和Oct3/4表達情況

傳第3代的iPSCs用免疫細胞化學染色法檢測ESCs特異性標志SSEA－1和Oct3/4表達情況，可見2種iPSCs都明顯表達ESCs特異性標志物SSEA－1和Oct3/4，見圖3。

Figure 3.Immunocytochemical analysis of WT－iPSCs(A －C，G－I)and MT1－MMP－deficient－iPSCs(D－E，JL).Expression of the pluripotency markers SSEA －1(A－F)and Oct3/4(G－L)was detected(×400).圖3 免疫細胞化學染色檢測ESCs特異性標志物SSEA－1和Oct3/4表達情況

4 體外iPSCs誘導分化培養(yǎng)EBs

從單個懸滴中吸出成形的懸浮EBs，轉(zhuǎn)入至預先以0.1%明膠包被的24孔培養(yǎng)板中(1－2個/孔)，光鏡下觀察擬胚體，可見2種細胞被重新編程為iPSCs后，都可形成EBs，而且MT1－MMP基因敲除－iPSCs形成的EBs與WT－iPSCs形成的EBs形態(tài)一致，見圖4。

Figure 4.The morphology of EBs derived from WT－iPSCs(A，C)and MT1－MMP－deficient－iPSCs(B，D)(×200).A，B:EBs induced to differentiate into EC-sC;C，D:EBs induced to differentiate into cardiomyocytes.圖4 體外iPSCs誘導分化培養(yǎng)

5 已經(jīng)形成的EBs肌鈣蛋白I和Flk－1免疫細胞化學染色結(jié)果

將已經(jīng)形成的EBs接種于提前鋪好明膠的35 mm的小皿中，貼壁后用免疫細胞化學檢測肌鈣蛋白I和Flk－1的表達，可見MT1－MMP基因敲除－iPSCs形成的EBs能夠表達肌鈣蛋白I和Flk－1，與WT－iPSCs形成的EBs的表達情況一致，見圖5。

Figure 5.Immunocytochemical staining of EBs derived from WT－iPSCs(A－C，G－I)and MT1－MMP－deficientiPSCs(D－F，J－L)induced to differentiate into ECs and cardiomyocytes(×400).Expression of the markers Flk－1/KDR(A－F)and troponin I(G－L)was detected.圖5 2種iPSCs誘導分化為內(nèi)皮和心肌細胞的EBs進行免疫細胞化學染色

6 單個內(nèi)皮和心肌細胞肌鈣蛋白I和Flk－1免疫細胞化學染色結(jié)果

將已經(jīng)分化好的EBs用胰酶消化，吹打形成單個細胞后，接種于提前鋪好明膠的35 mm的小皿中，貼壁后用免疫細胞化學檢測肌鈣蛋白I和Flk－1的表達，可見MT1－MMP基因敲除－iPSCs形成的EBs，吹打形成單個細胞后，也能夠表達肌鈣蛋白I和Flk－1，與WT－iPSCs的表達情況一致，見圖6。

討 論

目前iPSCs已經(jīng)廣泛被研究。2006年，研究人員將逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的Oct3/4、Sox2、c－Myc及Klf4 4個外源基因轉(zhuǎn)入鼠成纖維母細胞中，使成體細胞重新編程為具有多向分化潛能的干細胞[5，6]，即 iPSCs。通過 DNA 基因芯片分析，iPS細胞去甲基化狀態(tài)與 ES細胞幾乎相同[6]。iPSCs有著與ESCs相同的特性，但還具有ESCs沒有的優(yōu)點，iPSCs在臨床應用中不涉及免疫和道德問題，而且可以根據(jù)病人及他們的病因不同，制備出以病人和/或疾病為特異性的iPSCs?，F(xiàn)已有實驗室將iPSCs定向分化而來的造血前體細胞，移植給致死量照射處理后的小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不僅重建了小鼠的造血系統(tǒng)，而且將紅細胞形態(tài)由原先的鐮刀狀修正為圓盤狀[14]，這就說明了iPSCs將來可以運用于臨床的疾病治療中。

Figure 6.Immunocytochemical staining of single cells derived from WT－iPSCs(A－C，G－I)and MT1－MMP－deficient－iPSCs(D －E，J－L)induced to differentiate into ECs and cardiomyocytes(×400).Expression of the markers Flk－1/KDR(A－F)and troponin I(G －L)was detected.圖6 EBs吹打為單個內(nèi)皮和心肌細胞進行肌鈣蛋白I和Flk－1免疫細胞化學染色

本實驗通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的Oct3/4、Sox2、c－Myc及Klf4四個外源基因轉(zhuǎn)入到正常鼠的成纖維細胞中，將其重新編程為iPSCs，而且在國內(nèi)外首次將MT1－MMP基因缺失鼠的成纖維細胞重新編程為iPSCs。對已形成的2種iPSCs，本實驗中所用的檢測方法是根據(jù)ESCs所具有的特性進行的。首先用堿性磷酸酶染色，堿性磷酸酶顯色是免疫組化顯色的一種，是對iPSCs進行初步的一種檢測。ESCs中有許多多能的基因，如 SSEA － 1、Oct3/4、Sox2、Klf4、c － Myc、Nanog 及Lin28等，本實驗選取了SSEA－1和Oct3/4這2種多能的基因進行免疫熒光染色，并且將這2種多能的細胞向心肌和內(nèi)皮細胞分化，以驗證重新編程的iPSCs含有與ESCs有著相似的多能特性?；|(zhì)金屬蛋白酶是一類具有鋅指結(jié)構的內(nèi)肽酶家族，它能降解細胞外基質(zhì)，因此它在組織重塑，腫瘤發(fā)展和血管形成中起著重要的作用。MT－MMPs是一種固有的跨膜蛋白，它含有MMPs所有特征性的蛋白結(jié)構域，MTMMPs有6種亞型。與正常小鼠相比，MT1－MMP基因缺失的小鼠，可以表現(xiàn)出膠原代謝的缺陷，血管新生的反應延遲，并且由于血管形成缺陷，繼發(fā)引起骨化中心受損，從而導致骨形成障礙[15]。從MT1－MMP基因敲除鼠取下的血管，進行體外培養(yǎng)可以看到血管出芽生長缺陷，而從普通小鼠取下的血管，則可以看到血管正常出芽生長[16]。此外，MT1－MMP可能調(diào)節(jié)癌細胞誘導其血管生成的能力，表達MT1－MMP的腫瘤細胞生成迅速，并且能形成含血管豐富的腫瘤，MT1－MMP在腫瘤中的過表達進一步支持了它的親血管活性[13]。因此，MT1－MMP在新生血管中起著必不可少作用。

無論是正常細胞還是腫瘤細胞，細胞外的蛋白成分似乎對其微環(huán)境起著決定作用。MT－MMPs是細胞膜上重要的一類亞家族，它們與多種酶相聯(lián)系，調(diào)節(jié)著細胞外基質(zhì)。MT1－MMP主要作用是調(diào)節(jié)血管形成和裂解基質(zhì)成分，它與膜和胞漿內(nèi)分子相互作用，控制著一些細胞的功能[12]。因此，MT1－MMP發(fā)揮作用的信號轉(zhuǎn)導路線需要被進一步研究。本次實驗將MT1－MMP基因敲除鼠的成纖維細胞重新編程為iPSCs，經(jīng)過一系列的檢測發(fā)現(xiàn)該iPSCs與正常鼠成纖維細胞重新編程為iPSCs有著相似的特征，它可以表達ESCs特異性的抗體SSEA－1和Oct3/4，將其誘導可以向心肌和內(nèi)皮細胞分化。MT1－MMP基因敲除鼠血管、骨和軟骨形成障礙，根據(jù)我們研究發(fā)現(xiàn)將其重新編程為iPSCs后，它可以在體外分化為內(nèi)皮細胞。但是基因缺失在一定程度上是否可以重建;將MT1－MMP基因敲除鼠的iPSCs回輸?shù)組T1－MMP基因缺失鼠內(nèi)，血管再生、骨和軟骨生成情況是否有改善，還有待我們進一步研究。這就給我們新的啟發(fā)，從某些基因缺陷所致疾病的病人身上取得一些成體細胞，將其重新編程為iPSCs，然后再重新輸入到病人體內(nèi)，那么他們的基因缺陷能否可以修正，病情能否有所改善，這些都是我們要進一步研究的問題。

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