神經(jīng)干細胞移植對大鼠腦缺血損傷的影響及清熱化瘀方的干預*

胡躍強，唐 農(nóng)，雷龍鳴，祝美珍，畢方方，胡玉英，陳 煒

（1.廣西中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南寧 530023；2.廣西中醫(yī)學院經(jīng)典中醫(yī)研究所，

南寧 530001；3.中南大學湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，長沙 410008）

腦缺血所造成的神經(jīng)功能缺失一直為臨床治療的難點，中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元不可再生的觀念被打破后，腦缺血后神經(jīng)干細胞（NSCs）的移植、分化方面的研究成為當今神經(jīng)科學領(lǐng)域研究的熱點，這也為NSCs移植治療腦缺血損傷提供了可能。本研究通過觀察鼠NSCs移植治療腦缺血大鼠的效果及清熱化瘀方的影響，探討該方的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與耗材 DMEM/F12干粉培養(yǎng)基、B27、堿性成纖維生長因子（bFGF）、表皮生長因子（EGF）、5-溴脫氧尿苷（BrdU）均為 Sigma公司產(chǎn)品；小鼠抗 BrdU單克隆抗體（Chemicon，USA）及兔抗nestin單克隆抗體（Pharmingen公司）；兔抗神經(jīng)絲蛋白200（NF200）多克隆抗體（Santa Cruz，USA）；熒光素Cy3標記的兔抗IgG和FITC標記的羊抗IgG（北京中山）。

1.1.2 藥物 清熱化瘀方由水牛角30g、丹參15g、赤芍 15g、地龍 10g、石菖蒲 10g等中藥組成，單味中藥濃縮顆粒劑由江蘇省江陰市江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 NSCs的培養(yǎng) 取新生3d SD大鼠，用75％酒精浸泡30min后斷頭處死取出大腦，分離海馬，機械分離組織成單細胞，細胞以105/ml種入平皿，培養(yǎng)基用 DMEM/F12加 B27、bFGF（20ng/ml）和EGF（20ng/ml），2d更換半量培養(yǎng)基，10d左右用機械消化法進行傳代。將誘導擴增后的NSCs以105/ml種于0.1％明膠包埋的平皿中，放入含 5％CO2的培養(yǎng)箱中37℃常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 動物分組及處理 SD大鼠100只，重200g～250g，隨機分為假手術(shù)組（A組）、模型組（B組）、干細胞移植組（C組）、干細胞移植 +清熱化瘀組（D組），每組25只大鼠，各組按處死時間分為術(shù)后第 2、4、7、14、28天 5個亞組，每個亞組 5只動物。A組：線栓只插入頸內(nèi)動脈9mm；B組：動物造模后2h灌胃同清熱化瘀組等體積的蒸餾水，并給予側(cè)腦室注射等量生理鹽水；C組：大鼠在模型制作成功24h后進行 NSCs移植；D組：動物造模后，清熱化瘀湯14g/（kg·d）灌胃（按體表面積計算為臨床70kg成人劑量的3倍），各組動物均在術(shù)前6h灌胃1次，在手術(shù)清醒后開始灌胃，每天 1次，每次 1.4m1/100g大鼠，余同 C組。

1.2.3 動物造模 參照 Longa＇s線栓法阻斷左側(cè)大腦中動脈（MCAO）制備局灶性腦缺血模型。

1.2.4 NSCs移植 大鼠在腦缺血模型制作成功24h后進行NSCs移植。移植前NSCs經(jīng) Brdu（濃度5μmol/l）標記 2d，離心后將其溶解于生理鹽水中，細胞濃度調(diào)整為 6×105/ml。參照文獻方法［1］，將大鼠麻醉、固定，缺血側(cè)側(cè)腦室處（前囟左側(cè)旁1.5mm，前囟后 1.0mm）頭皮針垂直進針，在進入5.6 mm后各緩慢推入 10μl細胞懸液，留針 10min后緩慢拔針。

1.3 神經(jīng)功能缺損評分（NSS）

參照 Chen 等［2］方法，分別于移植后第 2、4、7、14、28天對大鼠進行 NSS，主要觀察其運動、感覺功能、平衡能力及生理反射能力；總分為18分，正常為0分，分值越高示其神經(jīng)損害程度越嚴重。

1.4 組織處理

將大鼠常規(guī)麻醉后，經(jīng)左心室先后用生理鹽水和4％的多聚甲醛進行灌注。然后取腦組織固定、脫水、石蠟包埋，按4μm厚度連續(xù)切片。

1.5 神經(jīng)干細胞增殖檢測

采用免疫組化ABC法。石蠟切片以1％H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，滴加正常山羊血清封閉液室溫下孵育 30min，接著分別滴加 1∶100稀釋的小鼠抗nestin單克隆抗體和兔抗 BrdU單克隆抗體，4℃過夜，然后以 PBS洗滌。再滴加 1∶100的二抗生物素化兔 IgG，PBS沖洗。陰性對照用正常羊血清代替一抗。

1.6 新生神經(jīng)元檢測

采用熒光雙標免疫組化法檢測BrdU和NF200表達雙陽性細胞為新生神經(jīng)元，小鼠抗 BrdU抗體（1∶100）以 Cy3標記，兔抗 NF200抗體以 FITC標記。被標記新生神經(jīng)細胞同時發(fā)出紅色（Cy3）核染區(qū)和綠色（FITC）胞漿染色區(qū)。

1.7 細胞圖像分析

用計算機圖像分析系統(tǒng)計數(shù)腦梗死后不同時間段陽性細胞數(shù)。每個動物隨機選取相同位置的6張腦片，每張腦片在大鼠腦缺血半暗帶隨機選取6個視野（×400），計算每個視野的免疫陽性細胞（BrdU、Nestin、BrdU/NF200）數(shù)目的平均值。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠NSS的比較

表1顯示，大鼠造模后出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損，其癥狀隨缺血時間的延長而逐漸減輕；NSCs組移植后第2、4、7天 NSS與模型組比較差異均無顯著性（P＞0.05），但第 14、28天其 NSS均顯著低于模型組（P＜0.05）；而 NSCS移植 +清熱化瘀組則在第7、14、28天的 NSS顯著優(yōu)于模型組（P＜0.05）。

表1 大鼠 NSS的變化±s）

表1 大鼠 NSS的變化±s）

注：與 B組比較：*P＜0.05

NSS組別2d 4d 7d 14d 28d B組7.8±1.7 7.2±1.6 6.9±1.6 6.6±1.5 6.0±1.2 C組 7.5±1.5 7.0±1.4 6.4±1.2 5.5±1.1* 4.8±1.0*D組 7.3±1.4 6.7±1.3 5.8±1.1* 5.0±1.0* 4.0±0.8*

2.2 大鼠缺血腦損傷后NSCs增殖的比較

模型組大鼠腦缺血損傷后可以檢測到少量的nestin陽性細胞，其表達于缺血后7d達高峰（P＜0.05），以后表達逐漸減弱；與模型組相比，NSCs組移植后 nestin表達在第 7、14、28天顯著增加；移植加中藥組在第14、28天時缺血半暗帶區(qū) nestin陽性細胞數(shù)較單純移植組顯著增加（P＜0.01，P＜0.05）。模型組大鼠腦缺血損傷后未能檢測到 BrdU陽性細胞，NSCs移植后可檢測到BrdU陽性細胞，主要分布在缺血周圍區(qū)，并可見其從室旁區(qū)向缺血區(qū)移行，其表達于移植后14d達高峰（P＜0.05），以后表達逐漸減弱；移植加中藥組在第14、28天時缺血半暗帶區(qū)BrdU陽性細胞數(shù)較單純移植組顯著增加（P ＜0.05）（見表 2、3圖① ～ ④）。

表2 各組大鼠 nestin蛋白陽性細胞數(shù)比較±s，n=5）

表2 各組大鼠 nestin蛋白陽性細胞數(shù)比較±s，n=5）

注：與 B組比較：*P＜0.05，＊＊P＜0.01；與 C 組比較：△P ＜0.05；與組內(nèi)其他時間點比較：#P＜0.05

組別 時相2d 4d 7d 14d 28d A組00000 B組 4.22±1.46 8.89±1.63 13.78±2.15# 9.20±1.78 7.67±1.60 C組 5.03±1.34 10.65±1.93 20.32±2.45#＊＊15.24±2.21＊＊ 11.56±2.02*D組 6.12±1.27 12.29±1.98 22.25±2.73 18.79±2.67△ 15.25±2.36△

表3 各組大鼠 BrdU陽性細胞數(shù)比較±s，n=5）

表3 各組大鼠 BrdU陽性細胞數(shù)比較±s，n=5）

注：與 C組比較：△P＜0.05；與組內(nèi)其他時間點比較：*P＜0.05

組別 時相2d 4d 7d 14d 28d A組00000 B組 0 0 0 0 0 C組 16.23±2.65 25.74±3.21 33.26±4.76* 48.55±6.32* 30.58±5.24 D組 18.36±2.87 29.13±3.36 40.05±5.50 60.49±6.68△ 47.66±5.87△

2.3 新生神經(jīng)元比較

NSCs移植后 7d可見，少量的 BrdU/NF200雙陽性細胞出現(xiàn)在缺血周圍處，其表達隨缺血時間延長而逐漸增加；移植加中藥組在第14、28天時缺血半暗帶區(qū)BrdU/NF200雙陽性細胞數(shù)較單純移植組顯著增加（P＜0.05）（見表4和圖⑤⑥）。

3 討論

NSCs是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有自我更新能力和多種分化潛能的細胞，雖然終身存在，但由于其絕對數(shù)量和局部微環(huán)境所限，致使中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷或變性時，自我修復作用微乎其微。因此，采用外源性干細胞移植成為近年來治療中樞神經(jīng)損傷的熱點研究領(lǐng)域，也同樣為腦缺血損傷的治療提供了新的思路。

表4 各組大鼠BrdU/NF200陽性細胞數(shù)比較± s，n=5）

表4 各組大鼠BrdU/NF200陽性細胞數(shù)比較± s，n=5）

注：與 C組比較：*P＜0.05

組別 時相2d 4d 7d 14d 28d B組0 0 0 0 0 C組 0 3.61±0.92 6.73±1.20 19.54±2.24 26.82±3.16 D組 0 5.24±1.08 9.24±1.33 31.60±3.57* 39.75±4.28*

①②:缺血7天C組和D組頂葉皮質(zhì)nestin蛋白表達(×400);③、④:缺血28天C組和D組頂葉皮質(zhì)BrdU陽性細胞表達(×400);⑤⑥:缺血14天C組和D組頂葉皮質(zhì)BrdU/NF200雙陽性細胞表達(免疫熒光 ×400)

已有研究證實，NSCs移植能夠促進局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能的恢復。如Park將NSCs注入缺血鼠腦中，NSCs可接合入變性的 CNS中，可優(yōu)先移入缺血區(qū)，并增殖分化為神經(jīng)元［3］。Shen等將 NSCs注入鼠腦缺血損傷區(qū)，可縮小缺血后腦梗死面積，改善神經(jīng)功能［4］。最近也有聯(lián)合移植的相關(guān)報道，如Yu等將NSCs和I型膠原聯(lián)合移植治療腦缺血，能夠顯著促進損傷腦組織結(jié)構(gòu)和功能的恢復［5］。中藥作為體內(nèi)微環(huán)境的調(diào)節(jié)劑，可能在減少神經(jīng)干細胞移植后的副反應，促進其分化和遷移等方面具有重要的作用，國內(nèi)在這方面也開始了有益的嘗試［6］，顯示出較大潛力。但聯(lián)合應用中藥復方和NSCs治療腦缺血的報道甚少，值得進一步探討。

“毒損腦絡(luò)”學說是中醫(yī)中風認識上的新理論，認為中風發(fā)病是由于毒邪損傷腦絡(luò)、絡(luò)脈破損或絡(luò)脈拘攣瘀閉、氣血滲灌失常所致［7］。結(jié)合腦缺血損傷后 NSCs的變化，我們認為腦缺血急性期產(chǎn)生的痰瘀熱毒混雜腦內(nèi)，損傷腦髓及腦絡(luò)，NSCs的增殖分化遷移之源受到抑制、破壞，導致神經(jīng)功能缺損及功能恢復受限。因此我們認為，解毒通絡(luò)是治療大法［8］，據(jù)此理論而設(shè)的清熱化瘀方，其功能為清熱解毒化痰、活血化瘀通絡(luò)，是治療腦梗死的有效方劑。一系列研究表明，其通過不同途徑對腦缺血損傷組織具有保護作用，作為腦神經(jīng)功能保護劑在臨床運用方面有較好的療效［9～11］。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血損傷可以誘導少量nestin的表達，且在缺血后 7d時表達呈高峰；經(jīng)BrdU標記的NSCs側(cè)腦室移植后2d即可見BrdU蛋白陽性細胞，主要分布在缺血周圍區(qū)，并可見其從室旁區(qū)向缺血區(qū)移行，其表達于移植后14d達到高峰，說明移植的 NSCs能夠在宿主腦內(nèi)存活；免疫熒光顯示，NSCs移植后 7d可見 BrdU/NF200雙陽性細胞出現(xiàn)在缺血周圍處，其表達隨缺血時間延長而逐漸增加，說明移植的 NSCs能夠分化為新生神經(jīng)元，也提示移植NSCs對腦缺血大鼠的神經(jīng)功能恢復起到了積極作用；移植加中藥組可顯著增加缺血后第14、28天時缺血半暗帶區(qū) nestin、BrdU和 BrdU/NF200陽性蛋白表達，說明清熱化瘀方可促進 NSCs增殖為神經(jīng)元并促進其遷移，從而發(fā)揮腦保護作用，這為其早期給藥治療提供了實驗基礎(chǔ)。

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