高脂飲食+STZ誘導的2型糖尿病模型大鼠表征及其證候動態(tài)演變研究*

吳 晏，韓 靜，黃黎明，郭淑貞，王 偉

（北京中醫(yī)藥大學，北京 100029）

高脂喂養(yǎng)合并腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素（STZ）是目前應用較多的2型糖尿病大鼠模型的制備方法。采取2次注射 STZ法，成模率高，死亡率低，且成模穩(wěn)定［1、2］。本研究復制此種動物模型設計觀察量表，連續(xù)12周全面、動態(tài)觀察動物的表征變化并判定其證候屬性，以判斷此種動物疾病模型在不同病變階段是否存在不同的表征和證候特點。

1 材料

1.1 動物

健康雄性5周齡 SD大鼠40只，體質量120g±10g，由北京維通利華實驗動物中心提供（許可證號為SCXK（京）2006-0001），飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學清潔級實驗動物中心，室溫18℃ ～25℃，相對濕度50％ ～60％，大鼠適應性飼養(yǎng)1周。

1.2 飼料

普通飼料和高脂飼料均由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所加工提供。高脂飼料配方：豬油12％，蛋黃粉10％，蔗糖10％，維持飼料68％。

1.3 試劑

檸檬酸（批號 0602102），檸檬酸鈉（批號20070403），購自北京化學試劑公司；STZ，Sigma公司。

2 方法

2.1 STZ 配制

配制0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，調節(jié)pH為4.4；配制 1％STZ溶液，溶于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，在冰浴中操作。

2.2 分組

按體質量將40只大鼠隨機分為正常組和模型組2組，每組20只。

2.3 造模方法

正常組給予普通飼料，模型組適應性飼養(yǎng)1周后，給予高脂飼料喂養(yǎng)。4周后，模型組第1次腹腔注射 STZ溶液35mg/kg，正常組腹腔注射同等劑量0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。第 1次注射STZ后2周，模型組大鼠再次腹腔注射 STZ溶液35mg/kg；正常組腹腔注射同等劑量 0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。尾靜脈采血測定空腹血糖（FBG），并進行口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）［3］，凡空腹血糖值≥7.8mmol/L者納入實驗［2］?？崭寡侵?＜7.8mmol/L者按照原劑量再腹腔注射1次STZ。

2.4 指標檢測

2.4.1 表征采集 表1顯示，課題組根據(jù)大鼠表征采集表對2組大鼠逐一觀察并判斷，從STZ注射前1周開始每周觀察1次。如遇分歧采用其中2人的相同觀點。

2.4.2 觀察指標 各組每2周測量1次體質量、24h飲食量、飲水量；注射 STZ前1d各組經(jīng)尾靜脈采血測定空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FIN）、總膽固醇（TG）、甘油三酯水平（TC），并測定 OGTT。2次STZ注射后第2、6周，各組大鼠尾靜脈采血測定FBG并測定 OGTT。2次STZ注射后第10周測定各組動物的 OGTT，然后經(jīng)腹主動脈取血檢測 FBG、FIN、TG、TC水平，并處死所有動物。血糖采用美國強生公司的onetouch隨手測血糖儀及血糖試紙測定。血清胰島素采用中國原子能科學研究院I1252胰島素放射免疫分析藥盒測定，用大鼠標準品繪制標準曲線。血清 TC、TG由全自動生化分析儀完成測定。

2.4.3 OGTT 大鼠禁食 15h后，灌胃給予20％的葡萄糖溶液2g/kg。檢測0min及葡萄糖灌胃后30、60、120min的血糖，計算葡萄糖曲線下面積（AUC）=（血糖值0min+血糖值 30min）×0.5/2+（血糖值30min+血糖值 60min）×0.5/2+（血糖值60min+血糖值120min）×1/2。

2.5 統(tǒng)計學方法

采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，數(shù)據(jù)用 珋x±s表示，組間比較用 One Way Anova方差分析。

2.6 判斷標準

大鼠表征屬性判斷標準參照《中醫(yī)診斷學》［4］。

3 結果

3.1 糖尿病大鼠的一般特征

表1 大鼠表征觀察量表

表2、3顯示，注射 STZ之前，模型組大鼠 FIN、TG水平明顯高于正常組大鼠水平（P＜0.05）；同正常對照組相比，模型組大鼠 FBG、空腹血清 TC水平無明顯差異（P ＞0.05）。

2次STZ注射后第2、6周，模型組大鼠FBG值均顯著高于正常組大鼠水平（P＜0.01）。2次 STZ注射后第10周，模型組大鼠 FBG、空腹血清 TG、TC值均明顯高于正常組水平（P＜0.05，P＜0.01），模型組大鼠FIN值與正常組相比無明顯差異（P＞0.05）。

3.2 大鼠葡萄糖耐量結果的比較

表4顯示，注射STZ之前，模型組大鼠與正常組大鼠的AUG水平無明顯差異（P＞0.05）；2次 STZ注射后第2周直至第10周，模型組大鼠的 AUG水平均顯著高于正常組大鼠（P＜0.01）。

表2 大鼠 FIN、TG和 TC水平的比較

表3 大鼠FBG水平的比較

表4 大鼠葡萄糖耐量結果的比較

3.3 大鼠的體質量變化

表5顯示，注射STZ之前，模型組大鼠與正常組大鼠的體質量水平無明顯差異（P＞0.05）；第1次 STZ注射后7d直至2次 STZ注射后第10周，模型組大鼠的體質量水平均顯著低于正常組大鼠（P＜0.01）。

表5 不同時間2組大鼠體質量、24h進食量、24h飲水量的比較

3.4 大鼠24h進食量和飲水量的變化

表5顯示，注射STZ之前，模型組大鼠與正常組大鼠24h進食量和飲水量無明顯差異（P＞0.05）；第1次STZ注射后7d直至2次STZ注射后第10周，模型組大鼠的24h進食量和飲水量均明顯高于正常組大鼠（P ＜0.05，P ＜0.01）。

3.5 2組大鼠表征變化的比較

模型組大鼠在2次 STZ注射后第1～4周出現(xiàn)活動次數(shù)增加比率、背溫升高比率、各自爬臥比率、舌色鮮紅比率、舌干少津比率、爪干燥或脫屑比率升高，并與正常組有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，P＜0.01）。

模型組大鼠在2次注射STZ后6～10周出現(xiàn)活動次數(shù)減少比率、毛潮濕比率、舌色鮮紅比率、舌干少津比率升高，并與正常組有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，P＜0.01）。

表6顯示，在第 1次注射 STZ后7d直至2次STZ注射后10周，模型組大鼠的尿量增加比率始終顯著高于正常組（P＜0.01）。

表6 2組大鼠表征比率的比較

4 討論

動物模型是中醫(yī)藥基礎研究的橋梁和重要載體，在中醫(yī)理論研究以及中藥新藥研究中，迫切需要能夠達到現(xiàn)代醫(yī)學疾病診斷標準的同時又能充分體現(xiàn)中醫(yī)辨證論治理論特點的新型動物模型，目前此項研究工作尚處于起步階段。以往的研究報道中，關于動物表征采集方面的內容報道較少，尤其是連續(xù)、全面地對不同疾病階段動物的表征進行采集的研究更為鮮見。本課題組拓展實驗動物表征觀察項目并進一步完善觀察方法，制訂出一套較為系統(tǒng)和全面的觀察量表。依據(jù)臨床病證結合條件下的證候診斷標準，按照相同或相似病理生理意義的原則，在動物模型將表征進行等效病理生理意義的轉化，以動物表征作為部分臨床四診信息的替代，然后根據(jù)中醫(yī)臨床證候診斷標準對模型動物的證型進行初步判定。

本研究結果提示，模型動物從2次 STZ注射2周后至 2次 STZ注射后 10周觀察結束，F(xiàn)BG、TG、TC、AUG值均明顯高于正常組水平；FIN值先升高后與正常組水平相似，同時出現(xiàn)模型動物體質量降低、尿量增加、24h進食量和飲水量增加。由此認為，本研究中2型糖尿病大鼠模型復制成功。在2次STZ注射后1～4周，與正常組相比，活動次數(shù)增加，背溫升高，各自爬臥，舌色鮮紅、舌干少津、爪干燥或脫屑比率均明顯升高，且多飲、多食、多尿、體質量降低。根據(jù)《中醫(yī)診斷學》中對于消渴陰虛內熱證咽干口燥、心煩畏熱、渴喜冷飲、多食易饑、溲赤便秘、舌紅苔黃的描述，認為在2次 STZ注射后1～4周，模型大鼠與陰虛內熱證的表現(xiàn)基本相符，故判定為陰虛內熱證型。在2次注射 STZ后6～10周，與正常組相比，模型大鼠的活動次數(shù)減少、毛潮濕、舌色鮮紅、舌干少津比率均明顯升高，且多飲、多食、多尿、體質量降低。根據(jù)《中醫(yī)診斷學》中對于消渴氣陰兩虛證咽干口燥、倦怠乏力、氣短懶言、多食易饑、口渴喜飲、溲赤便秘、舌紅少津的描述，認為在2次注射STZ后6～10周，模型大鼠與氣陰兩虛證的表現(xiàn)基本相符，故判定為氣陰兩虛證型。

由本研究結果可見，模型動物在同一疾病的不同階段其表征特點確有變化，并出現(xiàn)了統(tǒng)計學意義。由此，對同一時間點出現(xiàn)的多個表征進行匯總分析，將使對疾病模型動物進行中醫(yī)證型的判定成為可能。由本研究結果可見，在動物疾病模型中同樣存在著證型的階段性，即每種證型都具有一定的持續(xù)時間（時間窗），如陰虛內熱證在2次 STZ注射后1～4周出現(xiàn)，而氣陰兩虛證在2次STZ注射后6～10周出現(xiàn)。

病證結合動物模型的創(chuàng)建是中藥新藥對證治療評價的關鍵和基礎。建立病證結合動物模型日益受到關注并逐漸成為中醫(yī)實驗動物模型發(fā)展的新方向［5］。在疾病模型基礎上，動態(tài)觀察模型動物的宏觀表征和微觀指標，綜合結果進行證候判定，在此思路上構建的病證結合動物模型，具有客觀性強、可信度高以及更貼近臨床等特點，是證候動物模型發(fā)展的必然趨勢［6］。本課題組在高脂飼料合并注射 STZ所致的2型糖尿病大鼠模型中觀察到不同疾病階段的表征變化特點，用中醫(yī)診斷學的方法分別判定為陰虛內熱證和氣陰兩虛證，并初步確定了2種證型的時間窗。在下一步的研究中，本課題組將采用糖尿病陰虛內熱證和氣陰兩虛證的代表性方劑對模型動物進行方劑反證，以進一步驗證本研究所判定的動物證型的準確性，旨在探討并創(chuàng)建2型糖尿病病證結合動物模型研究的規(guī)律和方法。

［1］郭學軍，鄒移海，吳 凌，等.鏈脲佐菌素誘導 SD和 Wistar大鼠糖尿病模型的影響因素［J］.中國實驗動物學報，2008，16（4）：4-7.

［2］Ming Zhang，Xiao-Yan Lv，Jing Li，et al. The Characterization of High-Fat Diet and Multiple Low-Dose Streptozocin Induced Type 2 Diabetes Rat Model［J］. Experimental Diabetes Research，2008，704045：1-9.

［3］周迎生，高 妍，李 斌，等.高脂喂養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素注射的糖尿病大鼠模型特征［J］.中國實驗動物學報，2005，13（3）：154-158.

［4］朱文鋒.中醫(yī)診斷學［M］.上海：上?？茖W技術出版社，1995：149-153.

［5］許穎智，張軍平.病證結合在中醫(yī)辨證論治中的地位［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2008，26（11）：2362.

［6］劉 濤，王 偉.證候動物模型研究的思索［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2006，21（9）：550-551.