預測貝伐珠單抗抗腫瘤治療效果的生物學標記物

潘青青 王孟昭

目前在抗腫瘤治療中靶向治療為研究的熱門領域，其中抗血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的單抗——貝伐珠單抗受到了極大的關注。幾項大規(guī)模的臨床試驗[1-4]證明了貝伐珠單抗在抗腫瘤治療中的有效性，如AVF2107、E3200、ECOG4599、AVAiL等，基于此，美國食品藥品管理局已批準貝伐珠單抗與化療藥物聯(lián)合使用于轉移性結腸癌、非小細胞肺癌，在歐洲則被批準用于乳腺癌的治療[1]。貝伐珠單抗用于這些患者的獲益是明顯的，其療效評價和毒副反應如出血、血栓、高血壓等是進一步研究的對象。由此引發(fā)一個問題，何種患者對貝伐治療的治療會呈現(xiàn)最好的療效及最小的毒副反應？根據什么指標篩選這些患者？目前為止被研究的相關預測因子有很多，包括影像學檢查、臨床表現(xiàn)（如高血壓）、皮膚病變[5]及生物學指標等。其中生物學指標通過血清、血漿或組織學標本檢測可溶性及細胞表面標志物，并且分析RNA、DNA特征。由于其客觀性和可操作性，具有重要的臨床價值，也是本文主要討論的對象。

1 VEGF通路介紹

病理狀態(tài)下，VEGF在多種實體瘤及血液系統(tǒng)腫瘤中高表達，促進腫瘤血供和生長、眼內新生血管形成及參與炎癥反應、促進水腫，其中對腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響尤其引人關注[6,7]。

在哺乳動物中VEGF生長因子家族包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、胎盤生長因子（placenta growth factor, PIGF）。其中VEGFA基因包括8個外顯子和7個內含子，經過不同剪切形成5種同工體VEGF145、VEGF165、VEGF121、VEGF189、VEGF206[8]。VEGF受體主要位于內皮細胞，部分位于骨髓細胞上，包括三種：VEGFR1，其配體為VEGFA、VEGFB、PIGF；VEGFR2，其配體為VEGFA、VEGFC、VEGFD、VEGFE；VEGFR3是VEGFC、VEGFD的受體，也是酪氨酸激酶受體中的一員，主要與淋巴管的形成有關。另外VEGFR家族還包括共受體神經纖毛蛋白、人硫酸肝素糖蛋白，能促進VEGFR2與VEGF165的結合，延長其半衰期[9]。

由于貝伐珠單抗只與VEGFA結合，而VEGFA的受體是VEGFR1、VEGFR2。因而這里主要介紹這兩種受體及其信號傳導途徑[10]。除了血管內皮細胞，VEGFR1也在巨噬細胞、樹突狀細胞、成骨細胞表面表達。而VEGFR2還可表達在神經元等處。VEGFR2在胚胎早期表達增高，后期逐漸減低，并且在病理狀態(tài)下如腫瘤中表達增高。

VEGFA與VEGFR1、VEGFR2結合后引起受體胞內段的交聯(lián)、二聚化及酪氨酸激酶的激活，并導致不同細胞內作用位點的自身磷酸化，從而激活一系列下游的信號轉導[9]。VEGFR2的激酶活性比VEGFR1高，與其它經典酪氨酸激酶受體如表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）、血小板衍生生長因子受體相當[11-13]。除了配體受體途徑，有研究[12,14]顯示血流也可以直接激活VEGF系統(tǒng)而不依賴于配體。VEGFR2水平的下調對下游信號傳導起負向調節(jié)作用。

根據VEGF通路，供檢測的特異性生物學標志物按種類可分為：配體——VEGF（VEGFA）；受體——VEGFR1、VEGFR2、可溶性VEGF受體1（soluble vascular endothelial growth factor receptor 1, sVEGFR1）、sVEGFR2及下游代謝產物如磷酸化VEGFR1、2（phosphorylated-VEGFR1, p-VEGFR1; phosphorylated-VEGFR2, p-VEGFR 2）、VEGFR的降解片段等；基因——VEGF、VEGFR的DNA、mRNA。標本來源包括血液（全血、血清或血漿）及腫瘤組織。同時其它與腫瘤血管生成相關的細胞因子也是被研究的對象。以下就將分別對其介紹。

2 循環(huán)中的生物標記物

貝伐珠單抗是針對VEGFA的重組人源化單克隆抗體，因而很多研究把血清或血漿中的VEGF作為研究對象。Duda[15]、Baar[16]觀察到貝伐珠單抗治療后血漿VEGF呈增高趨勢，而Smerdel[17]則認為治療后血清VEGF較前降低。有5項臨床試驗（Goede、Burstein、Cohen、Horn、Han）[18-22]得出的結論是治療前的VEGF水平與治療反應無關，這里包括了對直腸癌、乳腺癌、頭頸部鱗癌、小細胞肺癌和卵巢癌等多種惡性腫瘤的臨床研究。只有Dowlati等[3]在對非小細胞肺癌的ECOG4599和Smerdel等[17]對多重耐藥卵巢癌的2項研究中發(fā)現(xiàn)治療前VEGF水平與治療反應有關。前者認為VEGF水平較高者對包含貝伐珠單抗的治療反應更好，而后者的結果卻剛好與其相反。需要注意的是以上各項試驗均只研究了治療前血清或血漿VEGF水平與治療反應之間的關系，沒有進一步研究治療后VEGF變化趨勢與療效之間是否有聯(lián)系。也有研究者檢測尿液中VEGF，Stopeck等[23]認為治療后尿液中VEGF輕度下降。雖然治療前尿液中VEGF與治療反應沒有聯(lián)系，但其水平較低者的疾病無進展時間（progression-free time, PFS）和總生存時間（overall survival, OS）卻更長。

除了直接檢測VEGF水平，也有關于其可溶性受體的相關研究。Smerdel等[17]研究發(fā)現(xiàn)，治療后sVEGFR1無明顯變化，而sVEGFR2在第二個療程后有所升高。Duda等[15]進一步以127 pg/mL為界，將治療前血漿sVEGFR1水平分為高低兩組，結果發(fā)現(xiàn)高水平sVEGFR1者不僅治療反應好，而且發(fā)生III°以上不良反應的幾率也小。

對于其它循環(huán)生物學標記物，由于貝伐珠單抗的抗血管生成作用，常被用于檢測的也是一些與血管生理病理有關的細胞因子，如血管細胞間粘附因子-1（vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1）、細胞間粘附因子-1（intercellular adhesion molecule 1, ICAM-1）、血管緊張素-2（angiopoietin 2, Ang-2）、E-選擇素（E-selectin）等。Baar[16]和Stopeck等[23]均發(fā)現(xiàn)治療后VCAM-1升高，但其變化與治療中是否包含貝伐珠單抗無關。另外Goede[18]、Baar等[16]認為治療前這些細胞因子，如VCAM-1、E-selectin、Ang-2，其水平較低者對治療的反應更好。而對ICAM-1則沒有得出類似結論，只是發(fā)現(xiàn)低水平ICAM-1者接受貝伐珠單抗治療后疾病的進展風險也低[3]。

除了細胞因子，Ronzoni等[24]還研究了結直腸癌患者全血里的循環(huán)內皮細胞（circulating endothelial cells,CECs），其中包括總循環(huán)內皮細胞（total circulating endothelial cells, tCECs）、靜息態(tài)（resting CECs, rCECs）或激活態(tài)（activated CECs, aCECs）循環(huán)內皮細胞以及循環(huán)內皮祖細胞（endothelial progenitor cells, CEPs）。結果發(fā)現(xiàn)與治療反應有關的是tCECs和rCECs，達到完全或部分緩解者的tCECs降低，而疾病無進展或部分進展的患者rCECs升高。

3 組織中的生物標記物

與貝伐珠單抗治療有關的組織學標記物，最常被研究的是VEGF及其受體VEGFR。Sathornsumetee等[25]對惡性膠質瘤患者進行了研究，結果顯示治療前腫瘤組織高表達VEGF者，從影像學上觀察到的治療反應更好。然而在對結直腸癌和復發(fā)耐藥卵巢癌患者的相關研究中，卻沒有發(fā)現(xiàn)這一關系。Hong、Han、Wedam等[22,26,27]進一步研究了治療后VEGF的變化趨勢與療效的關系，結果發(fā)現(xiàn)對于乳腺癌患者，治療有反應者VEGF下降的更明顯。這些結論的不一致，其中原因一是VEGF在腫瘤組織中的分布不均一；二可能與取材有關，如果是通過活檢方法獲得的標本，則其獲得的腫瘤組織量有限，代表性不夠；三是VEGF的基礎表達值與治療后的變化情況對療效的反應程度不同。

VEGF通路上除了VEGF，另一個關鍵點是VEGF受體。Wedam等[27]認為治療前VEGFR水平與治療反應無關，卻發(fā)現(xiàn)治療后VEGFR的活化狀態(tài)——p-VEGFR在部分緩解或疾病無進展的患者中呈下降趨勢，而在疾病進展者中升高。Cohen[20]也把p-VEGFR作為研究靶點，不過其觀察的是治療前p-VEGFR2與VEGFR2的比值，并得出其比值越高，治療后腫瘤縮小率更高的結論。

其它組織學標記物還有低氧誘導因子2α（hypoxiainducible factor-2α, HIF-2α）、碳酸酐酶9（carbonic anhydrase 9, CA9）及CD31-微血管密度（CD31-microvessel density, CD31-MVD）。相關的研究里，Wedam[27]、Sathornsumetee[25]沒有發(fā)現(xiàn)以上這些標記物與治療反應有關。Hong[26]、Han[22]則分別在結直腸癌和卵巢癌患者中發(fā)現(xiàn)，低表達CA9的患者疾病控制率高，而高水平CD31-MVD預測著較差的治療反應。CD31-MVD直接反映腫瘤血管增生情況，而CA9作為HIF-2α的下游因子，在腫瘤血管增生的誘因——缺氧時表達增高。因而兩者的研究結論共同說明腫瘤血管增生明顯，則治療反應下降。

4 基因相關的生物標記物

相關標記物的基因，標本來源可以是外周血也可以是腫瘤組織。Smerdel[17]檢測了治療前外周血中VEGF的DNA，結果發(fā)現(xiàn)VEGF-2578、-1154、-460、+405、+936這五個位點無論是與治療反應還是與生存指標都沒有關系。而ECOG2100和BOND-2[28,29]的標本都來自腫瘤組織，前者分析了乳腺癌組織中VEGF基因的多樣性，后者檢測了結直腸癌組織中VEGFR2基因的含量。結果兩者都沒有找到基因與治療反應間的關系，卻發(fā)現(xiàn)含有VEGF-2578 AA、VEGF-1154 AA或VEGFR2高表達者OS更長。進一步研究還發(fā)現(xiàn)含有VEGF-634 CC和VEGF-1498 TT者，出現(xiàn)毒副反應的幾率也較低。與此類似，Jain[5]也找到基因與治療副作用之間的聯(lián)系，其對多種實體腫瘤的VEGFR2基因做了研究，結論是攜帶VEGFR2 H472Q變異型基因者發(fā)生高血壓、手足皮膚病變的幾率高。雖然副作用不是預期療效的一部分，但也可以間接反映出治療是否起效，所以可以通過試驗，進一步去尋找基因與副作用或療效之間的關系。

5 總結

通過以上總結（臨床試驗具體內容見表1）可以發(fā)現(xiàn)，對于預測貝伐珠單抗的抗腫瘤治療效果，目前還沒有一個確實有效的預測標記物，無論是配體VEGF，還是與低氧相關的HIF-2α、CA9或與下游反應有關的VEGFR、CECs。但是如果標記物與VEGF通路的關系更特異，如活化的VEGFR——p-VEGFR，或聯(lián)合多個指標共同預測，比如p-VEGFR2/VEGFR2、CD31-MVD，預測的有效性有所提高。另外除了檢測各個標記物的基礎水平，還可以根據其治療后的變化趨勢來預測治療是否有效。

除了目前臨床試驗中常用到的生物學標記物，有些基礎試驗還通過機制研究，發(fā)現(xiàn)了一些新的標記物，如Zhang[10]在一項離體試驗中發(fā)現(xiàn)，正常組織低表達VEGFR1、高表達VEGFR2，鱗狀細胞癌的血管內皮細胞上卻高表達VEGFR1、低表達VEGFR2，則推測貝伐

珠單抗的作用應該是使VEGFR的表達“正常化”，即拮抗腫瘤組織產生過多的VEGF配體，繼而使腫瘤組織中的VEGFR1、VEGFR2表達“翻轉”。其還發(fā)現(xiàn)VEGF激活下游通路的過程中會降解VEGFR2，產生一種160 kDa新的多肽片段。如果能在臨床上檢測這些指標，研究其與貝伐珠單抗治療效果的關系，可能會更有助于找到更方便、確切及高效的生物學標記物。

表 1 相關臨床試驗：與預測貝伐珠單抗抗腫瘤治療效果有關的生物學標記物Tab 1 Clinical trials about predictive biomarkers for bevacizumab in anti-tumor therapy

表 1 相關臨床試驗：與預測貝伐珠單抗抗腫瘤治療效果有關的生物學標記物（續(xù)表）Tab 1 Clinical trials about predictive biomarkers for bevacizumab in anti-tumor therapy（Continued）