Survivin siRNA對人肺腺癌細胞SPCA1和SH77抑制作用的比較分析

劉全喜 董超穎 李麗君 孫捷 李春云 李亮

肺癌為常見的惡性腫瘤之一,數十年來肺癌的發(fā)病率和死亡率有明顯的增高趨勢[1].Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis family of protein, IAP)家族新成員[2],可選擇性地表達于惡性腫瘤組織中,而在除胸腺和生殖腺外的正常成人組織中不表達,這種特點使其成為目前惡性腫瘤診斷和治療的新靶點.近年來,隨著腫瘤分子生物學的發(fā)展以及對基因功能的深入研究,人們逐漸認識到基因治療后對腫瘤細胞命運起主要決定作用的是基因型,而非制劑的基因毒性,腫瘤細胞相關基因的表達水平是造成患者對同一化療藥物敏感性不同的主要原因[3].迄今為止,尚無科學研究比較分析不同肺癌細胞株小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)抑制survivin表達的效果.因此,本實驗將survivin siRNA轉染兩種肺癌細胞SPCA1和SH77,檢測其對肺癌細胞增殖抑制作用的不同.

1 材料與方法

1.1 實驗材料 根據真核表達載體pSi-survivin和pSiscrambled的構建[4]設計survivin siRNA和scrambled對照cDNA序列,以pGCsi U6/Neo/GFP為載體,構建表達載體測序鑒定.Survivin siRNA靶基因的cDNA序列(編碼基因368-386)為5′-GCAGttTGAAGAAttAAC-3′.

人肺腺癌細胞SPCA1和SH77來源于美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection, ATCC).用含10%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基,其內加入2 mmol/L的谷氨酰胺+0.05 mmol/L 2-巰基乙醇(2ME)+10%胎牛血清(胎牛血清).保持細胞濃度為2X104個/mL-9X104個/mL,在37oC、5%CO2飽和濕度的條件下培養(yǎng).用甘油作為其冷凍保護劑.2.5 g/L胰酶消化傳代.實驗時取對數生長期細胞.首先將細胞在10%FCS中培養(yǎng)2 d.然后每2天通過離心、洗滌6次且以傳代的方式收集細胞.

利用Qiagen去內毒素質粒提取試劑盒,大量提取去內毒素的重組質粒pSi-scrambled和pSi-survivin.接種SPCA1和SH77細胞于100 mL培養(yǎng)瓶中,細胞數約1X 106個,用10%新生牛血清但不含抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)液,在37oC培養(yǎng)至細胞占瓶底約80%-90%時,按Invitrogen公司的Lipofectamine 2000使用說明書進行轉染,質粒和轉染試劑的比例為2:1.轉染分組情況如下:①脂質體對照組;②pSi-scrambled對照組;③pSi-survivin SPCA1細胞實驗組;④pSi-survivin SH77細胞實驗組.

1.2 MTT法[5]檢測細胞增殖抑制 將SPCA1和SH77細胞種在96孔板中,100 mL培養(yǎng)基中1X104個細胞.將細胞分為3組,分別轉染空脂質體、pSi-scrambled和pSi-survivin質粒.細胞在37oC環(huán)境下培養(yǎng)48 h.每個孔加入50 mL的 MTT溶液.培養(yǎng)4 h后,樣品溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)中,并用酶標儀檢測樣品吸光度,測定波長492 nm,參考波長690 nm.光密度(optical density, OD)值表示試驗組和對照組的光密度.重復實驗3次.采用線性分析確定IC50值.

1.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率和細胞周期 SPCA1和SH77細胞培養(yǎng)為5X105個細胞/mL的細胞濃度,3個重復.孵育48 h后,轉染空脂質體、pSi-scrambled和pSisurvivin質粒處理的細胞進行平行對照.細胞用70%乙醇收集并懸浮(4oC、1 h).用胰蛋白酶進行收集并用PBS液沖洗3次.將懸浮顆粒置于250 mL PBS和100 mL Annexin V/PI溶液中.在避光室溫情況下碘化染色30 min,細胞懸浮液通過流式細胞儀(BD公司,美國)進行檢測.測定細胞周期,觀察G0/G1期、G2/M期、S期各期細胞所占的百分比,觀察是否存在凋亡峰.通過WinMDI 2.5版本軟件(TSRI流式細胞術)來分析.

1.4 半定量RT-PCR檢測survivin mRNA水平 轉染72 h后,利用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取細胞總RNA,RT-PCR擴增目的基因survivin和內參基因β-actin.反應體系中加入兩對引物,第一對是survivin基因的引物,即5′-GAATTCATGGGTGCCCCGACGTTGCC-3′和5′-AGATCTTTCTTCTTATTGTTGGTTTCC-3′,擴增片段長度為475 bp.第二對是β-actin基因的引物,即5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′和5′-CTCCTTAATGTC ACGCACGATTTC-3′,擴增片段長度630 bp.PCR反應條件:94oC、30 s,59oC、30 s,72oC、60 s,30個循環(huán)后,72oC延伸10 min.PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離,紫外燈下拍照.

1.5 Western blot檢測survivin蛋白含量 轉染72 h后,通過緩沖液裂解制備SPCA1和SH77全細胞裂解液,緩沖液中含有1%Nonidet P-40、乙磺酸50 mmol/L(pH7.5)、氯化鈉100 mmol/L、EDTA 2 mmol/L、焦磷酸緩沖液1 mmol/L、原釩酸鈉10 mmol/L、苯甲基磺酰氟1 mmol/L以及氟化鈉100 mmol/L.相同濃度的裂解液與十二烷基硫酸鈉反應-10%聚丙烯酰胺凝膠電泳,并用轉移緩沖液(Tris 25 mmol/L,甘氨酸192 mmol/L,甲醇10% [v/v])將其轉移到PVDF膜上.PVDF膜用Tris緩沖液(TBS: Tris10 mmol/L[pH7.4],氯化鈉150 mmol/L)沖洗,并用TBS-5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)在室溫下過夜,含有抗體的TBS-5%BSA孵育.ECL化學發(fā)光試劑盒(Kirkegaard & Perry Labo-ratories)顯色進行檢測survivin的表達.

1.6 統(tǒng)計分析 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行分析.3次獨立實驗的數據采用Mean±SD表示,實驗組與對照組的組間差異比較采用t檢驗分析,P<0.05為有統(tǒng)計學差異.

2 結果

2.1 siRNA轉染后抑制SPCA1和SH77細胞增殖 利用MTT法檢測各組轉染細胞的存活狀態(tài),以脂質體組的生存率作為100%,則pSi-scrambled對照組、pSi-survivin SPCA1實驗組和pSi-survivin SH77實驗組的生存率分別為95.2%、33.8%和36.4%,pSi-survivin SPCA1實驗組和pSi-survivin SH77實驗組出現(xiàn)了較大程度地生長抑制現(xiàn)象,與對照組相比較,均具有統(tǒng)計學差異.但是實驗組組間差異不明顯(圖1).

圖 1 Survivin siRNA轉染后抑制SPCA1和SH77細胞增殖.*:與對照組相比,P<0.05.Fig 1 The inhibition of SPCA1 and SH77 cells proliferation by survivin siRNA. *P<0.05, vs control group.

2.2 siRNA轉染后誘導細胞凋亡并引起G0/G1細胞周期阻滯 pSi-survivin SPCA1實驗組和pSi-survivin SH77實驗組與脂質體對照組相比,出現(xiàn)了明顯的細胞凋亡.與陰性對照組相比,pSi-survivin SPCA1實驗組和pSi-survivin SH77實驗組細胞的G0/G1期比例明顯增加,S期細胞減少,G2期細胞明顯減少,細胞阻滯在G0/G1期(表1).

表 1 Survivin siRNA誘導細胞凋亡和SPCA1和SH77細胞周期阻滯Tab 1 The cell cycle distribution of SPCA1 and SH77 cells apoptosis and cell cycle inhibition by the survivin siRNA

2.3 siRNA抑制轉染細胞survivin mRNA水平 轉染后72 h提取細胞總RNA,利用半定量RT-PCR方法檢測survivin基因轉錄水平(圖2A).運用GIS凝膠分析軟件光密度掃描分析,以脂質體對照組survivin產物與內參β-actin產物的電泳亮度比值定為1,則其它各組的比值分別為:pSi-scrambled對照組為0.57,pSi-survivin SPCA1實驗組和pSi-survivin SH77實驗組分別為0.76和0.33(圖2B).經統(tǒng)計分析與脂質對照組相比,其它三組均明顯降低.結果表明重組質粒pSi-survivin在mRNA水平上抑制了survivin基因轉錄.

圖 2 Survivin siRNA抑制SPCA1和SH77細胞survivin mRNA表達.A:RTPCR檢測結果;B:柱狀分析圖表明survivin siRNA有效地抑制了兩種細胞中survivin的基因表達.*:與脂質對照組相比,P<0.05.Fig 2 Expression of survivin mRNA in SPCA1and SH77 cell inhibited by survivin siRNA. A: Result of RT-PCR test. B: The analysis of survivin mRNA in SPCA1 and SH77. It shows that survivin siRNA inhibited survivin mRNA expression effectively. *P<0.05, vs Liposomes control group.

2.4 siRNA抑制細胞中survivin蛋白表達 與兩對照組相比,pSi-survivin SPCA1實驗組和pSi-survivin SH77實驗組的survivin蛋白表達受到了明顯抑制(圖3).結果證實survivin siRNA可在蛋白水平抑制survivin表達.

3 討論

中國是一個高發(fā)性肺癌的危險區(qū).對原發(fā)性肺癌治療仍然困難,并且依賴于基礎醫(yī)學研究.最近的研究[6-8]結果表明,細胞凋亡與腫瘤的發(fā)生、進展和轉移密切相關.Survivin作為一種新發(fā)現(xiàn)的IAP,具有抗凋亡和調節(jié)細胞周期的雙重功能,在人類眾多惡性腫瘤中廣泛表達,而在正常組織中不表達或低表達.目前,survivin已經成為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)最顯著的獨立預后影響因子之一[9-12].Survivin的選擇性分布特點使其成為腫瘤基因治療的理想靶點,針對survivin的基因治療具有良好的靶向性、特異性和安全性,可以促進腫瘤細胞凋亡并抑制其增殖,但對正常組織幾乎沒有不良影響.

圖 3 Survivin siRNA抑制SPCA1和SH77細胞survivin蛋白表達.A:Western blot檢測結果;B:柱狀分析圖表明survivin siRNA有效地抑制了兩種細胞中survivin的蛋白表達.*:與對照組相比,P<0.05.Fig 3 Expression of survivin protein in SPCA1 and SH77 cell inhibited by survivin siRNA A. Result of Western blot test; B: The analysis of survivin protein expression in SPCA1 and SH77. It shows that survivin siRNA inhibited survivin protein expression effectively. *P<0.05, vs control group.

令人感興趣的是,不同患者對相同化療方案的治療效果和反應有差別,特別是不同病理類型的肺癌患者對化療藥物的敏感性差異較大[13-16].為避免治療的盲目性,有必要探索不同細胞對化療敏感或耐藥的更深層的原因,以期為腫瘤的個體化療提供依據.近年來,隨著腫瘤分子生物學研究的發(fā)展,人們逐步認識到基因表達水平不但決定腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預后,而且與化療敏感性存在某種相關性.所以,本研究選擇了2種類型的人肺癌細胞株作為對象,用survivin siRNA分別轉染,檢測其對肺癌細胞的細胞周期、mRNA和蛋白表達水平的不同,探討同一種構建的survivin基因siRNA質粒對不同的細胞株是否有不同的作用效果.

本研究中我們構建了靶向survivin基因的siRNA表達質粒并轉染肺癌細胞SPCA1和SH77,通過半定量RTPCR及Western blot檢測結果表明,所構建的靶向survivin的siRNA表達載體具有高度的特異性,可有效地抑制SPCA1和SH77細胞中survivin mRNA及蛋白的表達;抑制SPCA1和SH77細胞survivin基因的表達可以顯著抑制細胞的增殖并誘導明顯的細胞凋亡.本研究與于振香等[17]的研究發(fā)現(xiàn)一致,即survivin的siRNA表達載體可抑制肺癌細胞A549的增殖,細胞受阻于G0/G1期,可抑制survivin mRNA及蛋白表達,并可誘導細胞凋亡.

可見,survivin siRNA可抑制多種細胞株的增殖,并可誘導細胞凋亡.有望進一步擴充細胞株,深入探討其功能.