吉非替尼對(duì)肺癌細(xì)胞株H358放療敏感性的影響及其機(jī)制

鄧潔 莊亮 陳元

肺癌是當(dāng)今世界上對(duì)人類(lèi)健康和生命危害最大的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占所有肺癌病例85%以上[1]。表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）是分子量為170 kDa的跨膜受體，在大多數(shù)上皮來(lái)源的腫瘤中表達(dá)增高，包括NSCLC[2]。放療作為NSCLC的重要治療手段，可直接或間接作用于DNA，其中DNA雙鏈斷裂（DNA double strand break, DSB）是最致命的[3]，但仍有一部分NSCLC對(duì)放療不敏感。野生型EGFR可在放療后1 h-4 h內(nèi)入核，進(jìn)行DNA損傷的修復(fù)而具有放療保護(hù)的作用；而NSCLC突變型EGFR不能入核修復(fù)，對(duì)放療相對(duì)敏感[3-5]。吉非替尼和厄洛替尼可抑制EGFR胞內(nèi)端酪氨酸激酶，阻止下游信號(hào)傳導(dǎo)，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[6]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究吉非替尼對(duì)NSCLC細(xì)胞株H358是否有放療增敏作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 NCI-H358為人NSCLC細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，EGFR野生型，在基因水平上擴(kuò)增，對(duì)吉非替尼敏感。主要試劑包括：吉非替尼（為阿斯利康公司贈(zèng)予），稱(chēng)重研磨溶于DMSO，終濃度為10 mmol/L，分裝后-20oC保存?zhèn)溆?。EGFR（14C8）：sc-81450（Santa Cruz公司），Anti-phospho-Histone H2A.X（Ser139），clone JBW301 （Millipore公司），Lamin B1 polyclonal antibody （Biovision公司），TRITC-II抗（Invitrogen公司），HRP-II抗（Antgene公司），BCA蛋白濃度檢測(cè)分析試劑盒（Thermo公司），細(xì)胞核漿蛋白分離提取試劑盒（Thermo公司），ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（GE Healthcare公司），Complete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets（Roche公司）。主要儀器包括：醫(yī)用直線加速器（瑞典ELEKTA-precise），激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司），凝膠成像灰度定量分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及照射方法 將H358細(xì)胞分為X線組和X線+吉非替尼組，前者進(jìn)行單純X線照射，后者為H358細(xì)胞在1 μg/mL吉非替尼作用24 h后進(jìn)行再進(jìn)行X線照射。H358細(xì)胞照射采用同濟(jì)醫(yī)院醫(yī)用直線加速器機(jī)架角180度，源皮距100 cm，6 MV X線等中心照射，平皿、細(xì)胞培養(yǎng)瓶或24孔板下墊1 cm厚有機(jī)玻璃板。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)采用含RPMI-1640培養(yǎng)液，10%胎牛血清，10,000單位/mL青鏈霉素的培養(yǎng)基，于37oC，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天換液，細(xì)胞傳代每4-5天一次。

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn) 消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)后按不同照射劑量接種合適細(xì)胞（0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy分別接種的細(xì)胞數(shù)為200、5,000、10,000、20,000、40,000）到60 mm直徑的平皿，兩組細(xì)胞每個(gè)劑量設(shè)3個(gè)副孔。培養(yǎng)貼壁后實(shí)驗(yàn)組加含吉非替尼濃度為1 μmol/L的培養(yǎng)液，對(duì)照組只換液，藥物作用24 h后分別進(jìn)行0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy X線照射，重新?lián)Q培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10 d-14 d。形成克隆后，結(jié)晶紫染液染色20 min，自來(lái)水充分沖洗后晾干，顯微鏡下計(jì)數(shù)每一劑量下含細(xì)胞數(shù)大于50個(gè)的細(xì)胞克隆數(shù)。以0 Gy組計(jì)算克隆形成效率（plating efficicy,PE），計(jì)算各個(gè)劑量下的細(xì)胞存活率（survival fraction,SF），PE=（0 Gy劑量下集落數(shù)/細(xì)胞接種數(shù)）*100%，SF=某一劑量照射組細(xì)胞形成的克隆數(shù)/（該組細(xì)胞種植數(shù)×PE），用Excel擬合劑量生存曲線，SPSS 13.0軟件利用單靶多擊模型計(jì)算2 Gy的克隆形成率（surviving fraction of 2 Gy, SF2）、平均致死劑量（mean lethal does, D0）、準(zhǔn)閾劑量（quasi-threshould does, Dq）、放射增敏比（sensitive enhancement ratio, SER）值。

1.5 免疫熒光 胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，稀釋至1×105/ml密度，接種約2,000/孔細(xì)胞至24孔板，使細(xì)胞在蓋玻片上貼壁生長(zhǎng)，以4 Gy X線照射，X線+吉非替尼組以1 μmol/L吉非替尼提前24 h預(yù)處理。后于以PBS洗，4%多聚甲醛于放療后不同時(shí)間（γ-H2AX分別于放療后0 min，10 min，30 min，1 h，3 h，6 h，12 h，24 h）固定，EGFR于放療后0 min，15 min，30 min，45 min，60 min，3 h）固定細(xì)胞15 min，PBS洗3遍，0.2% Triton X-100室溫作用15 mim，PBS洗3遍，5%山羊封閉血清室溫孵育1 h，加I抗1：100（γ-H2AX, EGFR）、4oC過(guò)夜，PBS洗3遍，TRITC-II抗1：50、37oC避光孵育50 min，PBS洗，1 μg/mL Hoechst33342避光孵育15 min，PBS洗，甘油封片，固定至載玻片上，避光放置，激光共聚焦顯微鏡觀察照相。

1.6 免疫印記 以4 Gy X線照射兩組生長(zhǎng)至鋪滿瓶底80%-90%的細(xì)胞，X線+吉非替尼組以1 μmol/L吉非替尼提前24 h預(yù)處理，以放療后不同時(shí)間（0 min, 15 min, 45 min,60 min）胰酶消化，離心收集細(xì)胞，提取細(xì)胞核蛋白，BCA法測(cè)各組核蛋白濃度。制備5%濃縮膠，8%分離膠，以60 μg蛋白上樣，電泳，275 mA電流轉(zhuǎn)至PVDF膜140 min，5%脫脂奶粉室溫封閉90 min，EGFR及Laminb1以1：1,000稀釋4oC孵育過(guò)夜，PBS洗，HRP-II抗以1：5,000稀釋室溫孵育2 h，PBS洗，ECL室溫作用5 min后稍吸干，于暗室膠片曝光。掃描膠片，凝膠成像灰度定量系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取均數(shù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 克隆形成實(shí)驗(yàn)擬合劑量生存曲線 圖1是用Excel軟件擬合的H358細(xì)胞劑量生存曲線，以放療劑量為橫坐標(biāo)，SF值取對(duì)數(shù)作為縱坐標(biāo)，結(jié)果顯示兩組數(shù)據(jù)擬合的曲線分開(kāi)，X線組各個(gè)劑量的SF值均大于X線+吉非替尼組，X線組SF2值為0.011,1，D0值為4.435，Dq值為5.399，X線+吉非替尼組SF2值為0.000,865，D0值為2.487，Dq值為2.494，SER值為2.815。

圖 1 H358細(xì)胞劑量生存曲線Fig 1 H358 cells dose-survival curve

2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察放療后細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)情況 圖2為激光共聚焦顯微鏡照相顯示H358細(xì)胞經(jīng)4 Gy X照射線后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)的情況，藍(lán)色底代表H358細(xì)胞核，紅色光點(diǎn)即為γ-H2AX焦點(diǎn)。X線組放療后10 min細(xì)胞核內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)γ-H2AX焦點(diǎn)并隨時(shí)間增加，在60 min達(dá)高峰，隨后遞減（圖2A）；而X線+吉非替尼組的γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)均比X線組多，而且一直持續(xù)到放療后12 h細(xì)胞核內(nèi)還有較多γ-H2AX焦點(diǎn)，24 h仍存在（圖2B）。

2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察放療后EGFR入核情況 激光共聚焦顯微鏡觀察照相顯示H358細(xì)胞4 Gy放療后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞核內(nèi)EGFR表達(dá)情況，藍(lán)色代表H358細(xì)胞核，紅色光點(diǎn)為EGFR，X線組0 min時(shí)EGFR焦點(diǎn)位于胞漿或核周，在放療后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，45 min達(dá)高峰，后逐漸減少（圖3A）；而在X線+吉非替尼組，EGFR焦點(diǎn)分布在核外胞漿中，沒(méi)有單純放療組的入核趨勢(shì)（圖3B）。

2.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)EGFR表達(dá)及蛋白條帶灰度定量分析 圖4為Western blot檢測(cè)H358細(xì)胞放療后1 h內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)核蛋白EGFR的表達(dá)，X線組在放療后15 min細(xì)胞核內(nèi)即有EGFR表達(dá)，且條帶隨時(shí)間而加深（圖4A）；而X線+吉非替尼組無(wú)EGFR核蛋白條帶（圖4B）。根據(jù)蛋白條帶采用凝膠成像灰度定量系統(tǒng)計(jì)算各條帶的灰度值，并繪制成柱狀圖（圖4C），X線組的灰度值均高于X線+吉非替尼組（P=0.042）。說(shuō)明H358細(xì)胞在放療后1 h內(nèi)，在各個(gè)相同的時(shí)間點(diǎn)，X線+吉非替尼組細(xì)胞核EGFR表達(dá)少于X線組，可能是吉非替尼通過(guò)某種途徑阻止EGFR放療后進(jìn)核。

3 討論

ErbB家族由EGFR（erbB1）、erbB2（Neu）、erbB3和erbB4四個(gè)成員組成，屬于跨膜糖蛋白。配體結(jié)合導(dǎo)致胞內(nèi)EGFR的二聚體化，進(jìn)而激活受體及下游的各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如Ras/Raf/MEK/ERK、PKC、STATs和PI3K/Akt途徑[7,8]。在腫瘤細(xì)胞，EGFR激活引起的信號(hào)通路主要調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞存活、細(xì)胞周期進(jìn)展及血管生成[9]。腫瘤細(xì)胞EGFR及下游信號(hào)通路的激活有以下途徑：①配體與EGFR過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞結(jié)合；②配體非依賴(lài)的途徑：EGFR突變或EGFR下游信號(hào)分子突變，如RAS或PTEN[10,11]。另外，放療也可導(dǎo)致EGFR及其下游信號(hào)通路的激活。這些途徑的激活在腫瘤治療引起的化療及放療耐受中起著重要作用[12,13]。

圖 2 激光共聚焦顯微鏡觀察H358細(xì)胞4 Gy放療后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)的情況。A：X線組；B：X線+吉非替尼組。Fig 2 Immunostaining for confocal microscopy testing for nuclear γ-H2AX foci of H358 cells after 4 Gy X ray. A: X ray group； B:X ray+Gefitinib group.

放療是NSCLC治療的重要組成部分，真核生物中，放療所致的DSB修復(fù)有兩種方式：同源重組（homologous recobination, HR）和非同源斷端連接（nonhomologous ends jion, NHEJ），其中NHEJ在放療導(dǎo)致的DSB修復(fù)中占主導(dǎo)地位[14]。NHEJ由DNA依賴(lài)性蛋白酶（DNA-PK）、XRCC4、DNA連接酶IV及ATM催化，與Mre11、Rad50和Nbs1（MRN）形成復(fù)合物從而使DSB斷端再連接而修復(fù)[15]。但是除了SCLC與NSCLC之間敏感性的差異，同一組織類(lèi)型的敏感性差異也存在。研究[16]顯示，EGFR是決定放療敏感性的重要因素之一，野生型EGFR可以在放療后入核，與DNA-PKcs結(jié)合，從而對(duì)DSB進(jìn)行修復(fù)，因而對(duì)放療抵抗；而突變型EGFR則不能入核與DNA-PKcs結(jié)合，所以對(duì)放療相對(duì)敏感?；贓GFR在腫瘤放療修復(fù)中的作用，分子靶向藥物小分子酪氨酸激酶受體抑制劑（tyrosine kinase recepter inhibitor, TKI）及作用于EGFR的單克隆抗體被單藥或與化/放療聯(lián)合用于臨床。西妥昔單抗（C225）與放療聯(lián)合用于頭頸部腫瘤，患者的總生存率明顯比單純放療組高。這可能基于西妥協(xié)單抗對(duì)腫瘤細(xì)胞的放療增敏作用，這已在臨床前的研究[17,18]中證實(shí)。研究[17]顯示，C225是通過(guò)抑制放療引起的EGFR入核，廢除EGFR-DNA-PKcs的相互作用，從而延遲DNA損傷修復(fù)，起到頭頸部腫瘤放療增敏的作用。吉非替尼是小分子受體抑制劑，它通過(guò)與EGFR酪氨酸激酶結(jié)合而起作用，本實(shí)驗(yàn)旨在探討吉非替尼是否與C225相似有對(duì)NSCLC有放療增敏的作用以及可能機(jī)制。

本課題選取H358細(xì)胞株，它是EGFR野生型人NSCLC細(xì)胞株，EGFR在基因水平上擴(kuò)增，對(duì)吉非替尼敏感。選擇1 μg/mL吉非替尼作為增敏濃度，是根據(jù)吉非替尼的每日處方劑量后測(cè)患者的血藥濃度及H358的IC20而定[16]。吉非替尼的半衰期為24 h。

圖 3 激光共聚焦顯微鏡觀察H358細(xì)胞4 Gy放療后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞核內(nèi)EGFR焦點(diǎn)的情況。A：X線組 B：X線+吉非替尼組。Fig 3 Immunostaining for confocal microscopy testing for nuclear EGFR foci of H358 cells after 4 Gy X ray.A: X ray group； B: X ray+Gefitinib group.

圖 4 Western blot檢測(cè)H358細(xì)胞4 Gy放療后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞核內(nèi)EGFR的表達(dá)情況。A：X線組；B：X線+吉非替尼組；C：EGFR帶灰度定量柱狀圖。Fig 4 Western blot testing for nuclear EGFR of H358 cells after 4 Gy X ray. A: X ray group； B: X ray+Gefitinib group； C:The densitometric analysis of EGFR expression.

克隆形成實(shí)驗(yàn)證明吉非替尼可提高人NSCLC細(xì)胞株H358的放療敏感性。從20世紀(jì)60年代，人們開(kāi)始用離體細(xì)胞存活曲線來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞放射的效應(yīng)，因其可以反應(yīng)細(xì)胞增殖性死亡，故仍最適于反應(yīng)細(xì)胞照射后存活情況。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)H358細(xì)胞放療后克隆形成情況，計(jì)算SF值繪制劑量生存曲線，可以看到X線+吉非替尼組各個(gè)劑量的細(xì)胞存活率均低于X線組，SF2值也同樣如此。且X線+吉非替尼組的D0、Dq也低于X線組，SER為2.185。說(shuō)明前者放療后發(fā)生增殖性死亡的細(xì)胞多于后者，大部分細(xì)胞因喪失了繼續(xù)增殖生長(zhǎng)的能力而不能形成克隆，即吉非替尼使H358細(xì)胞的放療敏感性增加。

實(shí)驗(yàn)還顯示，吉非替尼增加放療引起的H358細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX的表達(dá)，并延長(zhǎng)其存在時(shí)間。在真核細(xì)胞中，外源性化學(xué)、物理及生物性物質(zhì)所致的DSB都可能會(huì)觸發(fā)H2AX的快速磷酸化，從而形成γ-H2AX?？捎妹庖邿晒饧夹g(shù)，清楚地觀測(cè)到以γ-H2AX焦點(diǎn)形成為特征的DNA雙鏈斷裂的區(qū)域，這種染色質(zhì)的改變通常被認(rèn)為是細(xì)胞對(duì)DSB做出的敏感反應(yīng)。γ-H2AX的形成在DNA的DSB中不僅起到損傷的標(biāo)志性作用，而且在DNA的DSB修復(fù)中具有連接的作用[19]。實(shí)驗(yàn)中，X線+吉非替尼組放療后細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均多于X線組，焦點(diǎn)持續(xù)的時(shí)間也更長(zhǎng)，說(shuō)明吉非替尼增加了放療引起的DSB形成，使H358細(xì)胞DNA損傷增加，并使DNA修復(fù)延遲。結(jié)合之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果，吉非替尼通過(guò)影響放射后H358細(xì)胞的損傷及修復(fù)而提高放療的的敏感性。

另外，通過(guò)免疫熒光激光共聚焦顯微鏡觀察顯示放療后H358細(xì)胞核內(nèi)EGFR的變化，結(jié)果是X線組EGFR在放療后1 h內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞核，而X線+吉非替尼組各組EGFR光點(diǎn)位于細(xì)胞漿及核周。與共聚焦結(jié)果相符，Western blot實(shí)驗(yàn)證明，X線組H358細(xì)胞放療后1 h內(nèi)EGFR表達(dá)隨時(shí)間增加，而X線+吉非替尼組細(xì)胞核內(nèi)沒(méi)有EGFR表達(dá)，兩組結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。由于EGFR可通過(guò)放療激活進(jìn)行下游信號(hào)通路的傳導(dǎo)，其中野生型EGFR可直接在放療后入核，與DNA-PKcs結(jié)合進(jìn)行DSB修復(fù)起到放療保護(hù)的作用，結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以推測(cè)，吉非替尼是通過(guò)抑制EGFR放療后入核進(jìn)行DSB修復(fù)，而增加H358細(xì)胞放療敏感性。

腫瘤細(xì)胞的EGFR在放療后迅速入核， EGFR基因敲除的細(xì)胞因DNA修復(fù)被抑制而顯示出明顯的放療增敏作用[20]，這說(shuō)明在細(xì)胞受到放射線后EGFR在腫瘤細(xì)胞的存活中起著重要作用，核內(nèi)EGFR與DNA損傷的修復(fù)有著必然的聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，EGFR是影響H358細(xì)胞放療敏感性的重要因素，尤其是野生型EGFR高表達(dá)NSCLC，而吉非替尼能夠通過(guò)與EGFR結(jié)合，使EGFR不能進(jìn)入核內(nèi)進(jìn)行放療后損傷的修復(fù)，從而使放療敏感性增加。也有研究[21]顯示，吉非替尼可通過(guò)抑制ATM的活性從而制止放療引起的DNA損傷修復(fù)及誘使有絲分裂停止使細(xì)胞死亡而起到放療增敏的作用。

然而，吉非替尼是否還通過(guò)其它途徑影響H358細(xì)胞放療敏感性；入核后是否通過(guò)影響EGFR-DNA-PKcs復(fù)合物的形成而起作用，抑制DNA-PKcs的活性是否會(huì)對(duì)核內(nèi)EGFR的表達(dá)及放療敏感性產(chǎn)生影響，后續(xù)的研究正在進(jìn)行；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與體外實(shí)驗(yàn)是否能得出相同的結(jié)論；能否將EGFR作為放療增敏的靶點(diǎn)應(yīng)用于臨床，以上問(wèn)題還需要進(jìn)一步的體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。