高分辨熔解曲線法檢測非小細(xì)胞肺癌p53基因的突變

陳志紅 安社娟 謝至 嚴(yán)紅虹 陳劍光 蘇健 張緒超 牛飛玉 郭偉浜 吳一龍

p53基因是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類多種腫瘤相關(guān)性最高的基因。野生型p53基因是一個腫瘤抑制基因，而其突變型則具有致癌作用，p53基因突變廣泛分布外顯子5-8，可達(dá)95%-98%[1,2]。但p53的突變熱點(diǎn)較多，比較分散，目前通常采用組織DNA直接測序法檢測p53基因突變，費(fèi)時且昂貴，無法滿足臨床需要。本研究旨在建立高分辨熔解曲線（high resolution melting, HRM）檢測非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者p53基因突變的方法[3,4]，探討p53基因突變的特點(diǎn)及其在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的演變規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 病例組為2007年-2009年廣東省人民醫(yī)院的NSCLC患者腫瘤標(biāo)本，共264例，均為漢族，男184例，女80例，年齡23歲-88歲，均經(jīng)病理學(xué)診斷確診，且在知情同意后簽署了知情同意書。對照組為肺癌患者的癌旁組織標(biāo)本，共54例，均為漢族，男38例，女16例，年齡28歲-62歲。

1.2 主要試劑與儀器 HRM分析必需試劑：LightCycler 480 High Resolution Melting Master（瑞士Roche公司）；其它試劑和儀器：DNA 抽提試劑盒（上海華舜公司）、pGEM-T（美國Promega公司）、Gel Extraction Kit（德國Qiagen公司）、BIGDYE （美國Applied Biosystems公司）、核酸蛋白測定儀（德國Eppendorf公司）、PCR擴(kuò)增儀（美國BD公司）、LightCycler 480熒光定量分析儀（瑞士Roche公司）、ABI3100測序儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集和DNA提取 組織在手術(shù)切除后快速凍存于液氮中，-80oC保存待用。將冰凍切片評估腫瘤組織含量＞50%的標(biāo)本用于檢測。組織樣本（50 mg）中的DNA提取按照基因組DNA 抽提試劑盒說明書操作。使用Eppendorf核酸蛋白測定儀測定DNA純度及含量，要求吸光度（A）值280/260＞1.80，調(diào)整DNA濃度至5 ng/μL。

1.3.2 HRM檢測 按照文獻(xiàn)[5]設(shè)計p53基因突變檢測引物，外顯子5-8的引物序列見表1。所有引物均由大連寶生物公司合成，用HPLC進(jìn)行純化。PCR體系包括10 ng的基因組DNA、1xPCR Master mix、3 mmol/L MgCl2、250 nmol/L的正反向引物，并用PCR級別的水補(bǔ)足至20 μL。所有的PCR均重復(fù)2次。PCR和HRM分析均在LightCycler 480熒光定量分析儀上進(jìn)行。PCR條件：95oC 10 m，95oC 10 s，60oC 15 s，72oC 25 s，45個循環(huán)。HRM分析條件：95oC 1 min，40oC 1 min，熔解曲線數(shù)據(jù)收集從65oC到95oC溫度上升率為1oC/s，且每升高1oC進(jìn)行25次數(shù)據(jù)采集。

1.3.3 p53基因突變型和野生型（wild-type, wt）質(zhì)粒的構(gòu)建 采用TA克隆法分別構(gòu)建p53基因外顯子5-8的野生型克隆和突變型克隆，即分別以p53外顯子5-8的測序結(jié)果為陽性的標(biāo)本的DNA和測序結(jié)果為陰性的標(biāo)本的DNA為模板進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物采用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，純化產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。37 °C過夜培養(yǎng)，篩選出重組體。將重組體加至細(xì)菌Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基，37 °C搖床孵育過夜，提取質(zhì)粒、測序，驗(yàn)證轉(zhuǎn)入序列的準(zhǔn)確性。序列正確的質(zhì)粒-20 °C保存待用。

1.3.4 HRM分析的靈敏性試驗(yàn) 野生型和突變型質(zhì)粒的DNA濃度均調(diào)整至5 ng/μL，然后按不同比例將二者混合，使得樣本中突變型質(zhì)粒所占的比例分別為2%、5%、10%、20%、50%、100%，各取1 μL混合質(zhì)粒DNA作為模板用于HRM檢測。

1.3.5 直接測序法檢測 HRM分析后，陽性標(biāo)本采用測序引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物按試劑盒操作說明書切膠過柱純化，以純化后的PCR產(chǎn)物為模板，在ABI3100測序儀上按測序試劑盒按照說明書進(jìn)行測序檢測。采用Chromas軟件分析測序圖譜，判讀p53基因外顯子5-8的突變類型。

表1 p53 HRM引物表Tab 1 p53 HRM primers

1.3.6 亞克隆測序 HRM法檢測陽性而PCR產(chǎn)物直接測序法檢測陰性的樣品，進(jìn)一步進(jìn)行亞克隆測序證實(shí)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HRM法的檢測靈敏性 如圖1所示，HRM法檢測p53不同外顯子不同比例的系列混合質(zhì)粒DNA，2次結(jié)果的重復(fù)性好，且可檢測出僅含2%-10%突變型DNA混合樣本中的突變，提示HRM法檢測p53基因突變的靈敏度可達(dá)2%-10%。

圖1 HRM法檢測p53基因外顯子5-8的敏感性結(jié)果。野生型和突變型質(zhì)?；旌虾笸蛔冃退嫉谋壤謩e為2% 、5%、10%、20%、50%和100%，分別顯示不同顏色的熔解曲線。A：外顯子5：藍(lán)（wt），綠（2%），紅（5%），棕（10%），黃（20%），灰（50%），紫（100%）；B：外顯子6：藍(lán)（wt和2%），綠（5%），紅（10%），紫（20%），黃（50%），灰（100%）；C：外顯子7：藍(lán)（wt，2%和5%），綠（10%），灰（20%），紫（50%），紅（100%）；D：外顯子8：紅（wt），綠（2%），藍(lán)（5%），黃（10%），紫（20%），灰（50%），棕（100%）。Fig 1 The exon 5-8 of p53 gene sensitive analysis by HRM. The mutation plasmid DNA was mixed with wild-type plasmid DNA to dilute the mutant allele to 2%, 5%, 10%, 20%, 50% and 100% of the total alleles. The melting curves of each dilution are shown in different color.A: exon 5: blue (wt), green (2%), red (5%), brown (10%), yellow (20%), grey (50%) and purple (100%);B: exon 6: blue (wt and 2%), green (5%), red(10%), purple (20%), yellow (50%) and grey (100%);C: exon 7: blue (wt, 2% and 5%), green (10%), grey (20%), purple (50%) and red (100%); D: exon 8:red (wt), green (2%), blue (5%), yellow (10%), purple (20%), grey (50%) and brown (100%).

2.2 HRM法和測序法檢測結(jié)果 HRM法檢測54例對照組的正常組織，未能檢出p53基因突變。264例NSCLC患者的組織，檢出具有p53基因突變104例，102例經(jīng)測序法得到證實(shí)，突變率為39.4%，1例經(jīng)亞克隆測序?yàn)橐吧停?例DAN量不夠無法進(jìn)行亞克隆分析；95例為點(diǎn)突變，其中錯義突變74例，無義突變6例，同義突變15例，其余7例為堿基插入和缺失導(dǎo)致的移碼突變，突變中堿基轉(zhuǎn)換突變占總突變的93.1%。各外顯子不同突變類型的HRM曲線及測序結(jié)果見圖2-圖5。

2.3 p53外顯子5-8的突變結(jié)果 p53外顯子5、6、7、8的突變率分別為11.7%、8%、12.5%、10.6%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.35），且各外顯子的突變率與吸煙、分化等臨床參數(shù)均無關(guān)（P＞0.05）。

2.4 p53基因突變與臨床病理特征的關(guān)系（表2） p53基因突變與性別有關(guān)，男性突變率（43.5%）明顯高于女性（30%）（P=0.039）。p53基因突變與年齡、吸煙、病理、分期和分化等臨床病理特征均無關(guān)（P＞0.05）。

圖2 p53外顯子5不同突變類型樣品的HRM曲線和測序結(jié)果。A：HRM曲線圖。藍(lán)（野生型），灰（樣品16），紫（樣品172），黃（樣品38），棕（樣品211）；B：測序結(jié)果。Fig 2 HRM difference plot and sequence data for some mutation samples for p53 exon 5. A: Difference plot of some samples. Blue (wt),grey (sample 16), purple (sample 172), yellow (sample 38) and brown(sample 211); B: Sequencing traces for sample16, 172, 38 and 211.

圖3 p53外顯子6不同突變類型樣品的HRM曲線和測序結(jié)果。A: HRM曲線圖。藍(lán)（野生型），棕（樣品60），黃（樣品251），綠（樣品199），紅（樣品97）；B：測序結(jié)果。Fig 3 HRM difference plot and sequence data for some mutation samples for p53 exon 6. A: Difference plot of some samples. Blue (wt),brown (sample 60), yellow (sample 251), green (sample 199) and red(sample 97); B: Sequencing traces for sample 60, 251, 199 and 97.

圖4 p53外顯子7不同突變類型樣品的HRM曲線和測序結(jié)果。A: HRM曲線圖。藍(lán)（野生型），綠（樣品21），紫（樣品127），灰（樣品132），紅（樣品220）；B：測序結(jié)果。Fig 4 HRM difference plot and sequence data for some mutation samples for p53 exon 7. A: Difference plot of some samples. Blue (wt),green (sample 21), purple (sample 127), grey (sample 132) and red(sample220); B: Sequencing traces for sample 21, 127, 132 and 220.

圖5 p53外顯子8不同突變類型樣品的HRM曲線和測序結(jié)果。A: HRM曲線圖。藍(lán)（野生型），紫（樣品48），灰（樣品167），棕（樣品154），綠（樣品147），黃（樣品67）；B：測序結(jié)果。Fig 5 HRM difference plot and sequence data for some mutation samples for p53 exon 8. A: Difference plot of some samples. Blue (wt),purple (sample 48), grey (sample 167), brown (sample 154), green(sample 147) and yellow (sample 67); B: Sequencing traces for sample 48, 167, 154, 147 and 67.

表2 p53基因突變與臨床病理特征的關(guān)系Tab 2 Correlation between p53 gene mutations and clinicopathologic features

3 討論

抑癌基因p53的突變已被證實(shí)與人類半數(shù)以上的腫癌發(fā)生有關(guān)。該基因編碼一種分子量為53 kDa的蛋白質(zhì)，命名為p53。一旦p53基因發(fā)生突變，p53蛋白失活，細(xì)胞分裂失去節(jié)制發(fā)生癌變。目前對p53基因變異與腫癌生物學(xué)行為關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌、胃癌、乳腺癌及大腸癌中，具有p53突變患者的惡性程度較高、預(yù)后較差[2,6,7]。本研究采用HRM結(jié)合DNA序列分析法在39.4%的NSCLC癌組織中檢出p53突變，且突變與臨床分期和分化程度均無關(guān)系，提示p53基因突變可能于肺癌早期就發(fā)生，并持續(xù)于腫瘤發(fā)展的全過程，有助于判斷NSCLC患者的預(yù)后。p53基因有多種突變類型，主要為點(diǎn)突變，導(dǎo)致堿基轉(zhuǎn)換，發(fā)生錯義突變，本研究結(jié)果與Lee等[8]的報道一致。Suzuki等[9]報道p53基因突變與吸煙有相關(guān)性，本研究結(jié)果顯示p53基因突變雖然在吸煙者中較多見，但吸煙與非吸煙患者間無統(tǒng)計學(xué)意義。p53基因突變在男性中的發(fā)生率明顯高于女性，這與Lee等[8]報道非吸煙女性中p53基因突變的發(fā)生率較低相一致。 p53基因突變的突變特點(diǎn)和分布等均無統(tǒng)計學(xué)意義，提示p53基因突變是自發(fā)性突變，可能是在DNA合成和修復(fù)過程中的隨機(jī)錯誤所致。

本研究共發(fā)現(xiàn)7例p53基因由于堿基插入和缺失導(dǎo)致的移碼突變，HRM法和測序法均可確定。其測序圖譜部分為單一峰，從突變位置開始為重疊峰。為確定是含有雜合突變還是由于PCR錯配而導(dǎo)致的重疊峰，可采用高保真酶重復(fù)進(jìn)行PCR和測序，如出現(xiàn)重疊峰的位置均一致，可判斷為雜合突變，因?yàn)镻CR錯配的發(fā)生點(diǎn)不是唯一的，每次均發(fā)生在同一點(diǎn)的幾率較少，或者進(jìn)行克隆性測序。

目前檢測基因突變的方法有很多，最常用的有直接測序法、熒光探針法、單鏈構(gòu)象多態(tài)（single-strand conformation polymorphism, SSCP）法、變性高效液相色譜法（denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC）等，各種方法均有不同的優(yōu)缺點(diǎn)。直接測序法由于能直接鑒別出具體突變的堿基，所以一直都被作為檢測突變的金標(biāo)準(zhǔn)。但這種方法步驟繁瑣，耗時長，費(fèi)用高，敏感性相對低，難以達(dá)到臨床上的需要。本研究使用的HRM法是近幾年來在國內(nèi)外興起的最新的單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphism, SNP）及突變研究的工具。它是通過熔解溫度（Tm）的遷移而產(chǎn)生不同形狀的熔解曲線來區(qū)分不同的基因型。這種方法不受突變堿基位點(diǎn)與類型的局限，無需根據(jù)不同的序列設(shè)計特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運(yùn)行高分辨率熔解，就可完成對樣品基因型的分析。HRM法所使用的PCR擴(kuò)增酶必須是熱啟動酶，減少非特異性擴(kuò)增，使用的染料必須是飽和染料，才能根據(jù)熔解曲線的不同來區(qū)分不同的基因型。應(yīng)用HRM法篩選NSCLC腫瘤標(biāo)本的p53基因突變樣品，具有操作簡便、快速、敏感、單管避免污染等優(yōu)點(diǎn)，完全符合臨床個體化治療的要求，值得推廣。