細(xì)小病毒H-1非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因?qū)θ宋赴┘?xì)胞的抑制作用研究*

王園園 劉 炯 李金輝 蕭樹東鄭 青# 汪 錚#

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科 上海市消化疾病研究所1（200001）南京軍區(qū)南京總醫(yī)院消化內(nèi)科2

細(xì)小病毒H-1是自主性細(xì)小病毒的主要代表之一，對腫瘤細(xì)胞和惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞有選擇性殺傷作用，而對正常細(xì)胞無影響[1]，有望成為新型的抗腫瘤制劑。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)已證實(shí)非結(jié)構(gòu)蛋白NS1是細(xì)小病毒H-1發(fā)揮細(xì)胞毒作用的效應(yīng)蛋白[1～3]。本課題前期研究[4]結(jié)果顯示，低分化胃癌細(xì)胞對細(xì)小病毒H-1的細(xì)胞毒作用較為敏感，可能與細(xì)胞中NS1蛋白的產(chǎn)生和集聚能力增高有關(guān)。本研究利用成功構(gòu)建的細(xì)小病毒H-1非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因重組真核質(zhì)粒為載體，旨在深入研究NS1基因?qū)Ω叻只赴┘?xì)胞株MKN28、中分化胃癌細(xì)胞株SGC7901和低分化胃癌細(xì)胞株MKN45的影響，從而為進(jìn)一步探討NS1基因的抗腫瘤效應(yīng)以及研究相關(guān)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、質(zhì)粒、細(xì)胞株和主要試劑

細(xì)小病毒H-1儲存液由海德堡大學(xué)德國癌癥研究中心（DKFZ）Rommelaere教授惠贈，細(xì)小病毒H-1非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1-NS1由劉炯博士成功構(gòu)建；真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1由金思特科技（南京）有限公司提供。不同分化程度的人胃癌細(xì)胞株 MKN28、SGC7901、MKN45由上海市消化疾病研究所凍存。質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，限制性內(nèi)切酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購自寶生物工程 （大連）有限公司，Unizol試劑（上海博星基因芯片有限責(zé)任公司），G418（Gibco，InvitrogenTMby Life Technologies），脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000（InvitrogenTMby Life Technologies），小鼠抗人 CD44單克隆抗體（BD 公司）。

二、方法

1.質(zhì)粒抽提：分別將pcDNA3.1空質(zhì)粒菌液和pcDNA3.1-NS1質(zhì)粒菌液涂于氨芐西林（Amp）抗性的LB培養(yǎng)板，倒置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)。挑選一單克隆菌落加入5 ml LB培養(yǎng)基，37℃搖床220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。按試劑盒說明書抽提菌液中的質(zhì)粒。

2.質(zhì)粒的雙酶切鑒定：對抽提得到的pcDNA3.1空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1進(jìn)行雙酶切鑒定， 反應(yīng)體系內(nèi)含 KpnⅠ1 μl、XhoⅠ1 μl、10×M 緩沖液 2 μl、質(zhì)粒 DNA 5 μl，加 ddH2O 補(bǔ)足至 20 μl，37℃酶切2 h。行1%瓊脂糖凝膠電泳。

3.重組質(zhì)粒的測序鑒定：取5 μl經(jīng)雙酶切鑒定的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1，送上海英駿生物技術(shù)有限公司，以NCBI/BLAST分析測序結(jié)果。

4.G418最佳篩選濃度確定：將MKN28、SGC7901、MKN45細(xì)胞按 105/孔分別接種于24孔板，并設(shè)置對照組（未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒）、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1轉(zhuǎn)染組，分別于100、200、300、400、500、600、700 μg/ml G418 濃度下進(jìn)行篩選，選擇在10～14 d內(nèi)使對照組細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度行下一步篩選試驗(yàn)。

5.質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞：參照LipofectamineTM2000試劑說明書，將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染胃癌MKN28、SGC7901、MKN45細(xì)胞，48 h后加入G418，于篩選濃度下（300 μg/ml）繼續(xù)培養(yǎng)4周，挑出單克隆細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)。

6.RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中NS1基因表達(dá)：Unizol試劑抽提 MKN28、SGC7901、MKN45 轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，NS1上游引物：5’-TCC ACA GCC TGC CAA GGT-3’， 下游：5’-CTC AAA TCC GCC TCG ATC TC-3’，片段長度87 bp。PCR反應(yīng)體系內(nèi)含模板 cDNA 2 μl、NS1 上下游引物混合液（10 μmol/L）2 μl、Premix Ex Taq 12.5 μl，以 ddH2O 補(bǔ)足至 25 μl。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定NS1表達(dá)。

7.裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)：4周齡雌性BALB/c裸鼠（中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心）30只，分為6組，每組5只，22℃無菌條件下飼養(yǎng)。MKN28、SGC7901、MKN45細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1后，以106/300 μl細(xì)胞懸液濃度皮下接種至裸鼠右側(cè)背部，觀察成瘤情況。3周后，將裸鼠處死，取出瘤體，測量瘤體長徑（a）、短徑（b），瘤體體積=ab2/2。同時(shí)瘤體行病理切片分析。

8.胃癌細(xì)胞CD44表達(dá)的檢測：胃癌MKN28、SGC7901、MKN45細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1后，用無酶細(xì)胞分離液消化，PBS洗滌2次，制成單細(xì)胞懸液。每種細(xì)胞均設(shè)置陰性對照管和CD44標(biāo)記管，每管200 μl懸液，加入小鼠抗人CD44-APC振蕩混勻，細(xì)胞與熒光素共軛抗體在室溫下避光孵化15 min。流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)5000～10 000個(gè)細(xì)胞，采用Cell-Quest軟件分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、雙酶切鑒定結(jié)果

pcDNA3.1空質(zhì)粒僅擴(kuò)增出一條5000 bp以上的條帶，而重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切后可見2條條帶，其中一條在5000 bp以上，與pcDNA3.1空質(zhì)粒大小一致，另一條大小約2000 bp，與 NS1 片段長度（2019 bp）吻合（見圖 1）。

二、重組質(zhì)粒的測序鑒定

重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1的測序結(jié)果經(jīng)NCBI/BLAST分析，其mRNA序列與已知序列完全吻合。

三、NS1基因表達(dá)

胃癌 MKN28、SGC7901、MKN45細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1后，均擴(kuò)增出大小為87 bp的NS1條帶，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞均未擴(kuò)增出任何條帶（見圖 2）。

四、裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1的MKN28細(xì)胞皮下接種2周時(shí)，分別有5只和4只裸鼠長出瘤體，平均體積分別為（461.04±18.09）mm3和（457.40±20.11） mm3，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。接種10 d左右，SGC7901和MKN45細(xì)胞空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組裸鼠即可觀察到瘤體；而接種轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1的SGC7901和MKN45細(xì)胞后，直至處死所有裸鼠均未觀察到腫瘤生長。

接種后3周，各胃癌細(xì)胞HE染色示細(xì)胞核增大，核深染、核分裂象增多，為腫瘤細(xì)胞特征（見圖 3）。

五、CD44表達(dá)

轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒后，MKN28細(xì)胞不表達(dá)CD44，SGC7901和MKN45細(xì)胞中CD44表達(dá)量分別為97.6%和92.6%；轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1后，MKN28細(xì)胞亦不表達(dá) CD44，SGC7901和MKN45細(xì)胞中CD44表達(dá)量明顯降低，分別為44.0%和41.2%（見圖 4）。

討 論

我國胃癌發(fā)病率在各種消化道惡性腫瘤中位居前列，嚴(yán)重危害人們的健康。在傳統(tǒng)放化療對胃癌療效不佳的情況下，積極探索低毒的有效靶向根除腫瘤的抗原是腫瘤基礎(chǔ)研究的方向。細(xì)小病毒H-1對腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有選擇性殺傷和抑制生長的作用，具有親瘤性和溶瘤性[5,6]。Ran等[4]和Liu等[7]前期觀察發(fā)現(xiàn)不同胃癌細(xì)胞對細(xì)小病毒H-1細(xì)胞毒作用的敏感性存在差異，并對其可能機(jī)制進(jìn)行了初步探討。Cornelis等[8]的研究表明，細(xì)小病毒的腫瘤抑制作用不僅可通過其在腫瘤細(xì)胞中的大量復(fù)制而實(shí)現(xiàn)，還可通過產(chǎn)生毒性NS1蛋白來發(fā)揮效應(yīng)。NS1是一種多功能蛋白，具有解旋酶、核酸內(nèi)切酶、ATP酶、DNA-nicking和序列特異性DNA結(jié)合活性，既可控制病毒DNA的復(fù)制和表達(dá)，還具有細(xì)胞毒性作用，與病毒抗腫瘤活性直接相關(guān)[9]。NS1的毒性效應(yīng)與細(xì)胞蛋白的磷酸化有關(guān)[10～12]，新近研究表明NS1蛋白通過連接細(xì)胞內(nèi)酪蛋白激酶（CK）Ⅱα與原肌球蛋白而調(diào)節(jié)激酶的底物特異性，從而參與介導(dǎo)CKⅡ依賴的細(xì)胞骨架的改變和細(xì)胞死亡[11,12]。

本研究選取3種不同分化程度的胃癌細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1和空質(zhì)粒后皮下注射裸鼠，結(jié)果顯示高分化胃癌MKN28細(xì)胞組裸鼠均可見腫瘤生長，且兩組腫瘤大小無明顯差異；中分化胃癌SGC7901和低分化胃癌MKN45細(xì)胞空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組裸鼠亦可觀察到腫瘤生長，而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1后均未見腫瘤生長，證實(shí)NS1基因?qū)χ械头只奈赴┘?xì)胞生長具有抑制作用。與Ran等[4]的低分化胃癌細(xì)胞株對細(xì)小病毒H-1細(xì)胞毒作用較為敏感的研究結(jié)果相一致。此外，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的SGC7901和MKN45細(xì)胞表面覆蓋了一層溶胞樣的膜狀物，而MKN28細(xì)胞未見此現(xiàn)象。

腫瘤干細(xì)胞的研究近年成為腫瘤研究的熱點(diǎn)之一，可通過識別出這一小部分細(xì)胞從而進(jìn)行靶向治療以徹底殺滅殘存的腫瘤細(xì)胞，阻止其轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。目前已報(bào)道了數(shù)種腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)記物，但關(guān)于胃癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物的文獻(xiàn)報(bào)道極少。Takaishi等[13]的研究發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞株MKN45、MKN74和NCI-N87中，細(xì)胞表面標(biāo)記CD44+的胃癌細(xì)胞具有自我更新、自分化等干細(xì)胞特性，體外無血清培養(yǎng)條件下可形成腫瘤球、在動物體內(nèi)具有致瘤性，且對化療和放療的耐受性更強(qiáng)，敲除CD44則導(dǎo)致腫瘤球形成能力和致瘤性明顯減弱。提示CD44+細(xì)胞具有胃癌干細(xì)胞特性，CD44與胃癌干細(xì)胞具有較強(qiáng)的相關(guān)性，可能是胃癌干細(xì)胞的表面標(biāo)記之一。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SGC7901和MKN45細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1后CD44含量明顯降低，而MKN28細(xì)胞轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1后均無CD44表達(dá)。提示NS1對胃癌干細(xì)胞潛在標(biāo)記物CD44具有抑制作用，NS1對分化程度不同的胃癌細(xì)胞株的敏感性差異可能與其對CD44的抑制作用有關(guān)，但具體機(jī)制還有待于深入研究。

綜上所述，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)小病毒H-1非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因后，胃癌細(xì)胞SGC7901和MKN45的致瘤能力受到抑制，并對胃癌干細(xì)胞潛在標(biāo)記物CD44有明顯抑制作用，說明細(xì)小病毒H-1非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因表達(dá)對中低分化的胃癌細(xì)胞有較好的抗腫瘤活性，可能與其降低胃癌干細(xì)胞表型CD44的表達(dá)有關(guān)，有望成為胃癌治療的新型生物制劑。但目前關(guān)于非結(jié)構(gòu)蛋白NS1抑瘤效應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明，胃癌干細(xì)胞特異性表面標(biāo)記物亦需進(jìn)一步明確，這將是今后研究的方向。

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