水蛭提取物對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞DNA去甲基化作用研究

田雪飛 ，孫 婧 ，方 圓 ，伍參榮 ，周 青 ，廖興華

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

DNA甲基化是復(fù)制后的修飾，在細(xì)胞增殖、分化過程中起重要作用。肝癌相關(guān)抑癌基因，例如P16基因等啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島甲基化，在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用[1]。已有部分研究證實(shí)中藥成分槲皮素[2]、CDP成分[3]及復(fù)方左金丸[4]等具有降低抑癌基因甲基化水平的作用，提示探索中藥DNA去甲基化作用對(duì)中醫(yī)藥抗腫瘤研究具有重要的意義。前期研究中我們發(fā)現(xiàn)水蛭提取物具有體外抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用[5]，為此本實(shí)驗(yàn)通過觀察水蛭提取物對(duì)肝癌細(xì)胞甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）表達(dá)的影響，研究中藥有效成分的DNA去甲基化作用，進(jìn)一步探討水蛭提取物的抗肝癌作用機(jī)制?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 水蛭購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，并由湖南省中醫(yī)藥研究院超微工程中心制備成水蛭超微粉。提取物參照研究組前期建立的液氮快速凍融法制備[5]：取水蛭超微粉1.5 g置15 mL離心管內(nèi)，加10 mL滅菌雙蒸水制成混懸液，再將離心管置液氮內(nèi)5 min取出，立即放入37℃水浴中迅速融解，重復(fù)3次，3 000 r/min離心10 min，取上清液0.22μm微孔濾膜濾過，冷凍干燥18 h即得水蛭提取物凍干粉，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 Trizol RNA提取試劑為美國Gibco公司產(chǎn)品，RT-PCR相關(guān)試劑及引物為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品或合成；胎牛血清、低糖DMEM培養(yǎng)基干粉為Gibco公司產(chǎn)品；5-脫氧雜氮胞苷 （5-Aza-cdR）為Sigma公司產(chǎn)品。兔抗人DNMT1、DNMT3a、DNMT3b多克隆抗體購自美國Abcam公司；二抗為生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞株HepG2購自中南大學(xué)湘雅細(xì)胞中心并保存。

1.1.4 儀器 倒置熒光顯微鏡 （日本OLYMPUS公司）；自動(dòng)酶標(biāo)儀（奧地利TECAN公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國Hitachi公司），基因擴(kuò)增儀（中國杭州大和熱磁力電子公司）；凝膠電泳儀（中國杭州博日科技公司）；凝膠圖像分析系統(tǒng)（中國上海天能科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2培養(yǎng)于含10%小牛血清，100 U/mL鏈霉素和青霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37℃，飽和濕度和5%CO2條件下培養(yǎng)，2～4 d更換培養(yǎng)基1次，常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 藥物干預(yù)濃度及分組 HepG2細(xì)胞接種24 h后分別用水蛭提取物、5-Aza-cdR處理。水蛭提取物臨用前用含10%小牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液溶解稀釋成工作濃度。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定工作濃度為 3.0、6.0、9.0、12.0、15.0 mg/mL；5-Aza-cdR臨用前用含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成工作濃度，根據(jù)文獻(xiàn)[6]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定工作濃度為 0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 μM；DNMTs 表達(dá)檢測(cè)以MTT檢測(cè)1/2 IC50含藥量作為工作濃度；均采用未加藥物處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 取對(duì)數(shù)生長期HepG2細(xì)胞接種96孔板，每孔接種2×104個(gè)細(xì)胞，分別培養(yǎng)48 h后每孔加入5 g/L MTT 10μL，37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入100μL DMSO，酶標(biāo)儀波長490 nm處檢測(cè)吸光度A值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按下列公式計(jì)算細(xì)胞抑制率：細(xì)胞生長抑制率（%）=（對(duì)照孔A值-試驗(yàn)孔A值）/對(duì)照孔A值×100%。根據(jù)不同藥物濃度條件下細(xì)胞生長抑制率數(shù)值進(jìn)行相關(guān)回歸分析，并根據(jù)回歸方程計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.4 RT-PCR 法 檢 測(cè) DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長期1×106個(gè)HepG2細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)6 h待貼壁后，換含水蛭提取物、5-Aza-cdR（IC50含藥量）的培養(yǎng)基處理，對(duì)照組以不含藥物的培養(yǎng)基處理。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，總RNA提取按Trizol試劑盒說明進(jìn)行，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度與純度，-70℃保存?zhèn)溆?。逆轉(zhuǎn)錄取2μL總RNA，10mM Oligo dT 1μL，用DEPC水補(bǔ)至總體積12μL，70℃ 5 min，冰上驟冷后加入5×buffer 4μL，20 mU/L RNA酶抑制劑 1 μL，10 mM dNTP 2 μL， 200 mU/L MMLV 1 μL，37 ℃ 反應(yīng) 60 min，94 ℃滅活 5 min。PCR序列根據(jù) Genebank中人 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、GAPDH cDNA序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。PCR反應(yīng)體系為總體積 25μL，其中 10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 0.2mM， 上下游引物各 0.5 mM，MgCL21 mM，Taq酶 0.25 μL，cDNA 模板 2 μL，余下用無菌ddH2O補(bǔ)足，引物序列及PCR反應(yīng)條件見表1。取PCR產(chǎn)物5μL在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳 (含0.5 mg/L溴化乙錠)，PCR條帶應(yīng)用Eagle EyeⅡ圖像分析處理系統(tǒng)分析結(jié)果，基因的相對(duì)表達(dá)水平等于該基因RT-PCR產(chǎn)物電泳條帶的灰度值/GAPDH RT-PCR產(chǎn)物電泳條帶的灰度值。

表1 PCR引物序列、反應(yīng)條件及擴(kuò)增的目的片段大小

1.2.5 免疫組化法檢測(cè)DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表達(dá) 對(duì)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞洗脫涂片于已消毒的載玻片上，37℃過夜；PBS液輕洗，用冷丙酮固定5 min，自然干燥，SABC法免疫組織化學(xué)染色(操作流程按說明書進(jìn)行)。顯微鏡下觀察DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白染色和在細(xì)胞中的分布情況。并對(duì)每組標(biāo)本計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞，計(jì)算染色陽性比率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)值變量資料以“x±s”表示，采用單因素方差分析，組間均數(shù)比較采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IC50采用直線相關(guān)回歸分析，根據(jù)回歸方程計(jì)算求出。

2 結(jié)果

2.1 水蛭提取物、5-Aza-cdR對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制作用的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，水蛭提取物、5-Aza-cdR以劑量依賴性方式抑制HepG2細(xì)胞增殖,增殖抑制率隨水蛭提取物、5-Aza-cdR的濃度增高而增加。水蛭提取物、5-Aza-cdR各劑量組吸光度OD值與對(duì)照組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。求出直線回歸方程水蛭提取物為y(增殖抑制率)=7.587x（藥物濃度）+7.488，計(jì)算可得作用HepG2細(xì)胞48 h時(shí)的水蛭提取物半數(shù)有效抑制濃度IC50=6.0 mg/mL，因此確定3 mg/mL為水蛭提取物進(jìn)行下一步試驗(yàn)的工作濃度；直線回歸方程5-Aza-cdR為 y(增殖抑制率)=55.357x（藥物濃度）-3.029，計(jì)算可得作用HepG2細(xì)胞48 h時(shí)的5-Aza-cdR半數(shù)有效抑制濃度IC50=0.96μM，因此確定0.48μM為5-Aza-cdR進(jìn)行下一步試驗(yàn)的工作濃度。見表2。

表2 水蛭提取物、5-Aza-cdR處理48 h后對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制作用

2.2 水蛭提取物對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達(dá)的影響

水蛭提取物對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達(dá)有抑制作用，IC50藥物濃度下處理 48 h 后，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達(dá)降低，與對(duì)照組比較兩者間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與陽性對(duì)照 5-Aza-cdR 組比較，對(duì) DNMT1 mRNA 表達(dá)降低要弱于對(duì)照組（P＜0.05），但水蛭提取物抑制DNMT3a、DNMT3b mRNA表達(dá)的作用要強(qiáng)于5-Aza-cdR，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見表 3，圖 1～3。

圖1 RT-PCR擴(kuò)增肝癌細(xì)胞HepG2 DNMT1 mRNA表達(dá)電泳圖

圖2 RT-PCR擴(kuò)增肝癌細(xì)胞HepG2 DNMT3a mRNA表達(dá)電泳圖

圖3 RT-PCR擴(kuò)增肝癌細(xì)胞HepG2 DNMT3b mRNA表達(dá)電泳圖

2.3 水蛭提取物對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表達(dá)的影響

對(duì)照組 HepG2 細(xì)胞 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b表達(dá)依次為DNMT1高度表達(dá)，而DNMT3a、DNMT3b分別中、低度表達(dá)。經(jīng)水蛭提取物處理后，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b 表 達(dá) 明 顯 降低 ， 尤 其DNMT3b表達(dá)降低最為明顯，與對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)，與陽性對(duì)照5-Aza-cdR組比較，DNMT1表達(dá)要高，但降低DNMT3a、DNMT3b效果明顯優(yōu)于5-Aza-cdR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。 數(shù)據(jù)見表 4。

表3 水蛭提取物對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達(dá)水平的影響（灰度值，目的基因/GAPDH）

表4 水蛭提取物對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表達(dá)水平的影響 （光密度值，）

表4 水蛭提取物對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表達(dá)水平的影響 （光密度值，）

組 別水蛭提取物組5-Aza-cdR組對(duì)照組DNMT1 562±183**△△323±241**1127±355 DNMT3a 496±164**△624±201*873±352 DNMT3b 182±84**△△341±127*483±212

3 討論

雖然肝癌細(xì)胞發(fā)生甲基化異常的模式目前仍不清楚， 但 DNMTs， 包括 DNMT1，DNMT3a，DNMT3b已被證實(shí)在肝癌細(xì)胞內(nèi)存在表達(dá)異常[6-7]。其中DNMT1在正常細(xì)胞S期復(fù)制過程中具有維持甲基化的功能，多數(shù)表現(xiàn)為散在的C被甲基化，而CpG島未被甲基化[8]。DNMT1高表達(dá)是CpG島甲基化紊亂的重要因素之一，DNMT1高表達(dá)總是伴有總基因組DNA低甲基化和癌基因低甲基化或抑癌基因高甲基化。通過siRNA靶向抑制DNMT1表達(dá)后腫瘤相關(guān)基因啟動(dòng)子如RASSF1A、p16等可發(fā)生去甲基化而重新表達(dá)[9-10]。

有報(bào)道及我們本課題組前期研究結(jié)果表明水蛭可通過直接殺傷、誘導(dǎo)分化及凋亡等機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用[5,11]，能否通過DNA去甲基化作用發(fā)揮抗腫瘤作用是值得研究的問題。本研究發(fā)現(xiàn)，水蛭提取物對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞具有增殖抑制作用，且具有劑量依賴性。HepG2細(xì)胞中DNMT1基因表達(dá)明顯增高，DNMT3a、DNMT3b基因呈中、低度表達(dá)。而經(jīng)IC50濃度的水蛭提取物處理后 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b基因表達(dá)顯著降低，尤其可完全抑制DNMT3b基因的表達(dá)，其蛋白表達(dá)也呈弱陽性。雖然水蛭降低DNMT1表達(dá)作用遠(yuǎn)低于對(duì)照藥物甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-cdR，但降低DNMT3a、DNMT3b的作用要優(yōu)于5-Aza-cdR。結(jié)果表明DNA去甲基化作用可能是水蛭提取物抗腫瘤的機(jī)制之一，也提示從抗腫瘤中藥中篩選DNA去甲基化中藥有效成分具有可行性。

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