華蟾素對肝癌細(xì)胞株SMMC-7721增殖、凋亡的影響

鄭培實，張 陽，蔣 葵，戴朝霞，徐麗葉，方立萍，丁曉蕾

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧 大連 116027)

肝癌是常見惡性腫瘤，近年來病死率呈逐年上升趨勢，對于晚期肝癌，缺少有效的藥物治療方案［1］。2010年3～10月，我們觀察了華蟾素對離體肝癌細(xì)胞株SMMC-7721增殖、凋亡的影響，旨在為肝癌的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫);華蟾素注射劑(安徽金蟾制藥廠);Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物發(fā)展有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2孵箱，使用10%胎牛血清(57℃滅活30 min)、青鏈霉素各100 U/ml的RPMI1640培養(yǎng)液。細(xì)胞為上皮樣貼壁細(xì)胞，每3 d傳代1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于試驗。

1.2.2 華蟾素干預(yù)及細(xì)胞增殖抑制率檢測 取對數(shù)生長期SMMC-7721細(xì)胞接種于96孔板，密度為7×103/孔，培養(yǎng)24 h。實驗組分別加入0.4、0.6、0.8 μmol/L華蟾素，每藥物濃度各設(shè)5個復(fù)孔，對照組不加藥。加藥后分別培養(yǎng)24、48 h后，各孔加5%四氮唑藍液10 μl，孵育4 h，洗滌后各孔加二甲亞砜200 μl，充分混勻溶解，酶標(biāo)儀測定570 nm波長處各孔的D值，計算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率(%)=(對照組D570值 -實驗組 D570值)/對照組 D570值 ×100%。

1.2.3 華蟾素干預(yù)及細(xì)胞凋亡率檢測 取對數(shù)生長期的SMMC-7721細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后實驗組加入華蟾素，使其終濃度為0.6 μmol/L，對照組不加藥。離心去培養(yǎng)基，PBS洗滌后，采用Annexin V-FITV/PI雙標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)避光室溫標(biāo)記30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 華蟾素干預(yù)及細(xì)胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3 mRNA檢測 分組及干預(yù)同1.2.3，藥物作用48 h后收集5×106/ml細(xì)胞于離心管中，離心去上清液;加入Trizol試劑，按說明書操作步驟提取RNA。采用RT-PCR法(凱基公司的RT-PCR反應(yīng)體系)檢測Caspase-3 mRNA相對表達量。

1.2.5 華蟾素干預(yù)及測Mcl-1蛋白檢測 采用Western blot法。分組及干預(yù)同1.2.3。藥物作用48 h后收集細(xì)胞提取總蛋白。以tubulin為內(nèi)參照，結(jié)果用Leica Qwin圖像分析軟件分析條帶光密度積分值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖抑制率 見表1。

表1 兩組細(xì)胞增殖抑制率比較(%)

2.2 細(xì)胞周期及凋亡率 見表2。

表2 兩組細(xì)胞周期所占比例及凋亡率比較(%，)

表2 兩組細(xì)胞周期所占比例及凋亡率比較(%，)

注:與對照組比較，*P ＜0.05

組別 G0～G1期 G2～M期 S 期 凋亡率實驗組 55.53 ±0.75 1.32 ±0.19 41.54 ±0.5417.26 ±0.89*對照組63.21 ±1.2410.21 ±0.13 24.33 ±1.453.21 ±0.43

2.3 Caspase-3 mRNA及Mcl-1蛋白表達 華蟾素作用48 h后，實驗組Caspase-3 mRNA分別為(0.54±0.10)%、(0.32 ±0.11)%，P ＜0.05;Mcl-1 蛋白分別為(0.60 ±0.14)%、(0.95 ±0.11)%，P ＜0.05。

3 討論

蟾蜍治療腫瘤有著悠久的歷史和豐富的文獻記載，目前用于多種腫瘤［2，3］，有研究提示其可能通過干預(yù)FAS通路發(fā)揮抗腫瘤作用［4］。但其在Mcl-1為中心的凋亡通路中發(fā)揮的作用尚不明確。本研究實驗組增殖抑制率明顯高于對照組，且呈時間和劑量依賴性，提示華蟾素作用于SMMC-7721離體細(xì)胞，可抑制其增殖，并且誘導(dǎo)其凋亡。

Caspase是一個含有半胱氨酸活性的胞質(zhì)蛋白酶家族，迄今至少發(fā)現(xiàn)14個成員。Caspase-3是目前發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡過程中激活的關(guān)鍵酶，也是細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)分子［5］。其作用之一是參與Mcl-1蛋白的降解［6，7］，而后者通過特定信號通路抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，其過表達可以促進惡性腫瘤細(xì)胞生存，可引起在人類的造血系統(tǒng)的腫瘤以及多種實體瘤，其亦是腫瘤對傳統(tǒng)的治療耐藥的一個關(guān)鍵因素。Mcl-1即髓系白血病基因，在細(xì)胞的生長和分化過程中是一個必要的抗凋亡因子，調(diào)節(jié)其表達的信號傳導(dǎo)通路中的任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)調(diào)節(jié)紊亂都會引起Mcl-1的過度表達，從而導(dǎo)致包括腫瘤在內(nèi)人類一些疾病的發(fā)生。Mcl-1過表達可引起包括肝癌在內(nèi)的多種實體瘤［8］，并且是腫瘤對傳統(tǒng)的治療耐藥的一個關(guān)鍵因素［9］。

本研究實驗組Caspase-3 mRNA表達量明顯高于對照組，Mcl-1蛋白表達量明顯低于對照組，說明華蟾素對SMMC-7721離體肝癌細(xì)胞具有增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用，其機理可能為使Caspase-3表達升高、Mcl-1表達降低。本研究為華蟾素治療肝癌提供了更深入的理論依據(jù)。

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