復合誘變在提高毛霉抗菌活性中的應用研究

趙昌會，羅靜瑤

（1.湖南科技學院生化系，湖南 永州 425100；2.海南大學農(nóng)學院，海南 ?？?570228）

總狀毛霉（Mucor racemosus）在腐乳的釀造過程中，不僅對腐乳獨特風味的形成有關鍵作用，而且其產(chǎn)生的多種酶類，如活性蛋白酶中的抗菌肽、細菌素、溶菌酶等都具有抗菌及抑菌功能，從而使腐乳能保存較長時間。毛霉菌種的優(yōu)劣直接影響到腐乳的產(chǎn)量和質量。優(yōu)良的生產(chǎn)菌種往往在使用過程中會出現(xiàn)性狀退化現(xiàn)象，從而導致產(chǎn)品的質量下降，嚴重時甚至不能正常生產(chǎn)。因此，對生產(chǎn)菌種進行誘變處理，篩選出抑菌能力強、生長速度快、孢子數(shù)量多的菌株是十分必要的。為此，筆者通過紫外線-氯化鋰及亞硝酸鈉復合誘變，以期篩選出高抑菌活性的毛霉菌株。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗菌株：毛霉M1（分離于廣合腐乳）；指示菌株：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及蠟樣芽孢桿菌（湖南科技學院微生物實驗室）；馬鈴薯和豆腐（市售）。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基；PSA培養(yǎng)基；誘變培養(yǎng)基（參考吳紅艷并加以改進）：PSA培養(yǎng)基加入3 g K2HPO4，1.5 g MgSO4?7H2O， 1.5 g LiCl，pH自然；生物測定培養(yǎng)基。

1.3 試驗方法

1.3.1 孢子懸液的制備從廣合腐乳中分離出毛霉M1，并通過純化培養(yǎng)出其成熟孢子。用生理鹽水將毛霉M1的成熟孢子制成孢子懸液，倒入滅菌的150 mL三角瓶中，振蕩25～30分鐘，使孢子分散和活化，過濾，制備成孢子數(shù)約107個/mL的單孢子懸液。

1.3.2 紫外線-氯化鋰復合誘變開紫外燈（15W）預熱30分鐘，使光波穩(wěn)定；取10 mL孢子懸液于無菌的培養(yǎng)皿中，置于離紫外燈30 cm的磁力攪拌器上；打開攪拌器，使孢子液分別在紫外燈下照射0（對照）、1、2、3、4、5、6、7、8分鐘；照射后在暗光條件下，取1 mL的誘變菌懸液加入到無菌試管中冰浴1小時，以抑制突變株中的修復酶活性，從而提高誘變率；將冰浴后的菌液0.5 mL涂布于誘變培養(yǎng)基上；做3個平行，以未經(jīng)誘變的菌液作為對照；25℃避光培養(yǎng)3天，計算相對致死率，挑選生長速度快、孢子數(shù)量多的菌株進行保藏。

1.3.3 亞硝酸鈉誘變處理取0.2 mol/L亞硝酸鈉溶液1 mL于大試管中，加入1 mL經(jīng)紫外誘變處理的孢子懸液后，立即加入pH 4.5的醋酸緩沖液1 mL，充分混勻后27 ℃水浴，誘變不同時間后加0.07 mol/L pH 8.6的Na2HPO4溶液2 mL以終止反應。然后將孢子懸液稀釋10倍，取1 mL涂布于PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)3天，計算相對致死率，并挑取菌落較大的菌株分離純化。

1.3.4 誘變菌株的抑菌能力將篩選的突變株接種到豆腐上發(fā)酵3天，在超凈工作臺上將腐乳搗碎，制備無菌浸出液，取200 μL，加到含指示菌生物測定平板的濾紙片（約6 mm）上，30 ℃培養(yǎng)3天，利用直尺測量抑菌圈的直徑。

2 結果與分析

2.1 紫外線-氯化鋰復合誘變的效果

孢子懸液經(jīng)紫外照射不同時間后，取樣稀釋，涂布于誘變培養(yǎng)基上，以未誘變的孢子懸液作對照，培養(yǎng)3天，統(tǒng)計誘變致死率。結果顯示，紫外線-氯化鋰對毛霉的致死作用顯著，120秒致死率接近80%，240秒幾乎致死所有孢子（見圖1）。因此，選取兩株誘變時間為120秒、生長速度較快的菌株做進一步試驗。

2.2 亞硝酸鈉誘變的效果

將紫外線-氯化鋰處理篩選的菌株培養(yǎng)于PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)3天，分別制取孢子懸液，經(jīng)亞硝酸鈉處理，取10倍稀釋的孢子懸液1 mL涂布于PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)3天，計算結果如圖2：經(jīng)亞硝酸鹽處理8～12分鐘，致死率在70%～80%。因此，從誘變8分鐘和12分鐘的平板上挑取菌落較大的菌株，經(jīng)純化得到菌株A和B。與出發(fā)菌株相比，菌株A和B的菌絲較短，孢子顏色較深，A的菌絲呈白色，出發(fā)菌株和菌株B的菌絲呈淺黃色。

2.3 誘變菌株的發(fā)酵

將菌株A和B及出發(fā)菌株分別接種于PSA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3天后，取0.5 mL的菌懸液分別接種到新鮮豆腐（每塊接種0.5 mL）上，25 ℃發(fā)酵3天。結果表明，誘變后的菌株接種的豆腐乳色澤偏黃，菌絲體不發(fā)達（圖3）。

2.4 誘變菌株的抑菌能力

出發(fā)菌株經(jīng)兩次誘變后，接種于新鮮豆腐上，培養(yǎng)3天后，A和B菌株的菌絲均較少，顏色為淡黃色或金黃色；抑菌活性較高，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及狀芽孢桿菌的平均抑菌直徑分別為18、14及13.5 mm，比出發(fā)菌株M1的抑菌直徑分別大80%、55.5%及50%；對A和B菌株進行傳代，均表現(xiàn)出良好的遺傳穩(wěn)定性。

3 結 論

以廣合腐乳中分離得到的毛霉為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線-氯化鋰120秒誘變篩選出的突變株再經(jīng)亞硝酸鈉8～12分鐘的誘變，得到A和B突變株，具有較強抑菌能力，傳代3次，都表現(xiàn)出較好的遺傳穩(wěn)定性，特別是B菌株，具有進一步研究及應用的價值。

[1]邵 偉，唐 明，李 鈴，等.復合誘變在毛霉高產(chǎn)蛋白酶菌株選育中的應用[J].江蘇調(diào)味副食品，2005，22（1）：24-27.

[2]王瑞芝.中國腐乳釀造 (第二版) [M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2009.

[3]吳紅艷，鄭喜群，姚 蕤，等.紫外線-氯化鋰復合誘變選育羧肽酶高產(chǎn)菌株[J].中國調(diào)味品，2004，（6）：15-17.

[4]王 惠，童應凱，吳兆亮，等.亞硝酸誘變選育黃霉素高產(chǎn)菌的研究[J].飼料工業(yè)，2006，27（8）：17-19.

[5]王海燕，王騰飛，王瑞明.基于氯化鋰復合紫外誘變：10-HDA高產(chǎn)菌株的篩選[J].食品科技，2007，32（12）：29-32.

[6]劉云秀，呂開斌.毛霉紫外線誘變育種[J].中國調(diào)味品，2006，（2）：20-24.

[7]祖國仁，辛雪嬌，孔繁東，等.紫外線-氯化鋰復合誘變篩選納豆菌高抑菌活性菌株及培養(yǎng)條件研究[J].中國釀造，2009，30（4）：187-189.